文章综述了滑液囊支原体病的病原特点、流行病学、临床症状、病理变化、诊断和防治措施的研究情况,以期为滑液囊支原体病的防治提供参考.

为了快速、准确检测鸡滑液囊支原体(MS),对MS标准株vlhA基因进行分析,设计并合成特异性引物和探针,优化反应条件,构建了基于vlhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法.结果显示,所构建方法标准曲线所对应的相关系数R2=1.000,斜率S=-3.452,截距I=43.950,表明标准质粒浓度与Ct值的线性关系良好;该方法除MS外,其他参考菌(毒)株均无目的基因扩增,其最小检测浓度为1×101copies/μL,组内重复及组间重复的变异系数均低于0.1;运用所建立方法与普通PCR方法对4份疑似MS临床样本进行检测,检测结果完全相符合;应用该方法对贵州省7个地区107份疑似MS样本进行检测,发现总体阳性率为26.17％.说明建立的方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床检测.

文章介绍了绵羊肺炎支原体的病原特征、致病性及致病机理、疫苗研制情况,并提出加强研究的方向,为该病的防治及疫苗开发提供参考.

为了研究鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)膜蛋白EF-Tu和pdhβ的免疫应答效果,试验针对目的基因设计特异性引物,经PCR扩增并构建原核表达载体,应用相关软件对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析,对目的蛋白进行诱导表达并进行动物免疫试验.结果表明:PCR扩增EF-Tu和pdhβ基因得到特异性条带,大小为1 185 bp和993 bp;成功构建了重组质粒pET32a-EF-Tu和pET32a-pdhβ;滑液囊支原体贵州分离株(MS-GZ-ZJ株)同其他流行株的EF-Tu基因同源性在99.7％～100％之间,pdhβ基因同源性在99.6％～100％之间,说明MS-GZ-ZJ株EF-Tu、pdhβ基因高度保守;EF-Tu、pdhβ蛋白的分子质量分别为43 ku和35 ku,是稳定的亲水蛋白;EF-Tu蛋白二级结构以α-螺旋、无规则卷曲和延伸链为主,pdhβ蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主.表达的蛋白大小与预期相符,EF-Tu蛋白主要为可溶性表达,pdhβ蛋白主要为包涵体表达;EF-Tu、pdhβ重组蛋白均能与MS阳性血清特异性结合.EF-Tu重组蛋白不能单独诱导细胞免疫应答,而pdhβ重组蛋白能刺激鸡群产生少量的白细胞介素4(IL-4),两个重组蛋白混合能诱导少量的IL-2和IL-4,但比疫苗组低很多;体液免疫应答效果不明确.说明单独使用经预测免疫原性好的蛋白质不一定能诱导动物机体产生良好的反应原性.

为研究p24蛋白在鸡毒支原体中的定位,对p24基因序列进行分析,PCR扩增p24基因并构建原核表达载体,表达p24蛋白,制备多克隆兔抗血清,ELISA测定其效价,提取鸡毒支原体总蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白通过Western blot进行亚细胞定位.结果显示:p24基因高度保守,全长576 bp,编码192个氨基酸;成功构建表达载体pCold-p24,经转化、诱导表达后获得重组蛋白rp24,大小约为35kDa;ELISA检测兔抗rp24血清效价为1:12800,说明rp24蛋白具有很好的免疫原性;Western blot显示rp24蛋白在膜蛋白免疫印迹条带较亮,在胞浆蛋白中条带弱,证明p24主要分布在膜表面,是鸡毒支原体的膜蛋白.试验结果为后续基因工程疫苗研制、诊断试剂盒研发、致病机理研究奠定基础.

[目的]获得鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)贵州流行株,以进一步开展其病原学及免疫学相关研究.[方法]从贵州省织金县某肉鸡场共采集107份疑似MS感染病鸡的咽拭子、肿胀关节和脚垫、肿胀组织渗出物进行PCR检测,对PCR筛选的阳性组织样本进行MS分离培养,并进行瑞氏染色、生化试验及VlhA基因序列分析.[结果]PCR检测筛选到20份阳性样本,从关节和爪垫阳性样本中分离到1株疑似MS,分离株在平板上生长出"煎蛋状"菌落;瑞氏染色可见蓝色细小的球形菌;生化试验中,分离株分解葡萄糖和麦芽糖,但不分解精氨酸、尿素等,与MS标准株生化结果一致;分离培养物经PCR扩增得到821 bp的目的片段;分离株VlhA基因核苷酸相似性分析表明该分离株为MS,与GenBank登录的国内其他地区流行株相似性有地域差异.与安徽、重庆、福建、广东、广西、湖北、湖南、江苏和云南等地区流行株相似性在90.3％～99.7％之间;该分离株与湖南MS流行株相似性最高,达到99.7％;但与国外参考流行株的相似性低;VlhA基因遗传进化树分析显示,该分离株与国内参考株亲缘关系较近,与国外参考株亲缘关系较远.[结论]本研究成功从引起关节和足垫肿胀的鸡中分离鉴定了1株MS贵州流行株,该分离株存在一定变异,为贵州省MS的分子生物特征及本病的诊断和防控研究提供了基础依据.

为建立一种能同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的双重PCR方法,根据MG gapA基因和MS vlhA基因设计合成特异性引物,通过对双重PCR扩增条件的优化,建立能够同时检测MG和MS的双重PCR方法.结果显示,双重PCR反应条件中最适退火温度为58℃,反应体系中最适模板浓度为5.76 ng/μL,最适引物量为1.25μL(10 mmol/L).特异性试验显示,所建PCR方法对MG、MS、MG/MS混合培养物均可扩增出相应的特异性条带,而对AIV疫苗、NDV疫苗、MO、E.coli、SE的基因组扩增结果均为阴性;敏感性试验显示,该方法对MS、MG最低检出核酸终浓度分别为0.045 ng/μL和0.09 ng/μL;临床应用性试验显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出MG和MS核酸.结果表明,该双重PCR具有良好的特异性、敏感性、临床应用性,可以用于临床病料中MG和MS的快速检测,为MG和MS感染的诊断和流行病学监测提供了一种简便适用的方法.

为查明某生态鸡养殖场鸡群出现死亡的原因,进行现场调查、临床症状观察、病理解剖和实验室病原学鉴别诊断.结果:鸡群发病率为8.2％,病死率为81.2％;主要症状和病理变化为呼吸道症状、下痢、消化道出血、关节肿大等;禽流感病毒、新城疫病毒、滑液囊支原体和鸡毒支原体核酸检测均为阴性;细菌分离培养鉴定显示为葡萄球菌感染;药物敏感实验显示分离菌对磺胺间甲氧嘧啶、硫酸粘菌素、硫酸安普霉素、泰妙菌素、替米考星、多西环素较敏感.

为了解猪瘟病毒贵州株GZPD E2基因变异情况,为贵州猪瘟疫苗的选择提供参考依据,试验采用RT-PCR方法对GZPD E2基因进行扩增,并对目的基因进行克隆、测序和序列分析.结果:(1)RT-PCR扩增获得大小为1343 bp的基因片段,与预期扩增大小相符.(2)目的基因克隆、测序分析显示,GZPD与国内毒株shimen株、C株等在E2基因上存在较高的同源性,为94.9％～99.9％;与国外毒株GPE、Koslov等的核苷酸同源性为95.1％～95.3％.(3)进化分析显示,GZPD与HuBei、C-ZJ-2008、C-strain、HCLV处于同一进化分支,而与shimen、CSFV-GZ-2009、Koslov、GPE处于不同的进化分支.结果表明:猪瘟病毒贵州株GZPD在E2基因上存在一定变异,提示贵州猪瘟病毒存在一定的进化.

为了方便、快速检测猪瘟和猪蓝耳病混合感染病例,试验根据GenBank登录的猪瘟病毒(CSFV)和蓝耳病病毒(PRRSV)基因序列,分别设计合成1对引物,建立检测猪瘟、猪蓝耳病的双重RT-PCR方法,并对引物浓度、退火温度进行优化.对优化后的RT-PCR方法进行特异性和敏感性试验,同时对临床样品进行检测.结果 表明:采用建立的RT-CPR方法对CSFV、PRRSV进行扩增,分别扩增出508 bp和320 bp特异性片段,最佳引物浓度为0.4 pmoL/μL,最佳退火温度为55℃.采用该方法对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性乙型脑炎病毒不能扩增出任何片段,特异性良好.对CSFV和PRRSV最低核酸检出含量分别为32.4 ng和2.4 ng,具有较好的敏感性.对贵阳市某规模化猪场采集的临床疑似病料检出率为100％.说明成功建立了一种快速鉴别诊断猪瘟和猪蓝耳病的双重RT-PCR方法,该方法具有较好的特异性、灵敏性和临床应用性,为猪瘟和猪蓝耳病的快速、准确鉴别诊断和防控提供了有效手段.

为定量分析贵州省临床用猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)活疫苗中病毒含量,根据GenBank中公布的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gB基因序列(登录号:M17321.1)设计1对特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法,并对来自6个不同厂家的猪伪狂犬病活疫苗进行含毒量分析.结果显示,试验成功建立了可用于PRV检测的实时荧光定量PCR方法,标准曲线中标准品各稀释度质粒拷贝数与Ct值呈良好的线性关系,标准曲线方程为:Y=-0.97X+33.66(R2=0.999),该方法最低检测病毒含量为3.19×101拷贝/μL,敏感性高且具有良好的重复性和特异性.应用所建立的实时荧光定量PC R方法对贵州省临床用6个厂家生产的猪伪狂犬病活疫苗的病毒含量进行检测,结果显示,6种市售猪伪狂犬病活疫苗(A～F)中病毒含量分别为1.67×107、4.83×105、2.64×106、4.27×107、3.39×106和3.68×105拷贝/μL,来自不同厂家的疫苗病毒含毒量存在明显差异,最大差异可达116倍,其中来自A、D厂家的两种猪伪狂犬病活疫苗具有较高的含毒量.本试验所建立的实时荧光定量PCR方法可用于猪伪狂犬病活疫苗病毒含量的快速检测和评价,对猪伪狂犬病活疫苗的质控和临床用疫苗选择具有一定的指导意义.

重大动物疫病紧急流行病学调查作为动物疫病流行病学的重要部分,与重大动物疫病防控实践紧密相关,是疫情应急处理的基础工作.本文从最初调查、现地调查、追踪调查、风险因素分析和风险因素调查、疫情处置和调查报告六个方面介绍了重大动物疫病紧急流行病学调查方法及步骤,希望能为省、市、县动物疫病预防控制机构开展重大动物疫病紧急流行病学调查工作提供参考.

为探究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)pcDNA3.1-TBP30-Hsp70融合表达质粒对小鼠细胞免疫应答影响,本试验构建了绵羊肺炎支原体pcDNA3.1-TBP30-Hsp70融合表达质粒.用已构建的pMD19T-P30和pMD19-Hsp70质粒为模板,采用基因定点突变(SDM)原理设计引物,应用SOE-PCR扩增目的基因片段,并将其定向克隆至表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA 3.1 (+)-TBP30和融合重组质pcDNA3.1 (+)-TBP30-Hsp70.使用pcDNA3.1-TBP30、pcDNA3.1-TBP30-Hsp70、pcDNA3.1(+)和Elution Buffer对小鼠进行免疫,应用ELISA试剂盒检测小鼠血清中细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、干扰素-γ(INF-γ)分泌水平.结果 显示,pcDNA3.1-TBP30-Hsp70酶切后可见大小分别约为1 413 bp的目的基因片段和5 400 bp的载体条带.与空白对照组和pcDNA3.1(+)组相比,免疫重组质粒组均可引起小鼠血清中细胞因子INF-γ、IL-2和IL-4分泌水平的增强,与空白对照组和pcDNA3.1(+)组相比差异显著或极显著(P＜0.05;P＜0.01);而空白对照组和空质粒组之间差异不显著(P＞0.05);免疫pcDNA3.1-TBP30和pcDNA3.1-TBP30-Hsp70组小鼠血清IL-2、INF-γ和IL-4终分泌量增加,表明重组质粒组可刺激小鼠血清中IL-2、INF-y和IL-4的变化,并且在时间上都呈现出先增多后减少的规律.本试验结果表明,重组质粒pcDNA3.1 (+)-TBP30-Hsp70免疫小鼠后,IL-2和INF-γ分泌水平的升高,增强了机体的细胞免疫功能,进而调节机体细胞免疫影响T细胞和巨噬细胞的分泌,从而提高机体细胞免疫能力;IL-4分泌水平升高,促进机体Th2向Th1分化,维持Th1的优势状态,增强了机体的细胞免疫功能.本试验结果为绵羊肺炎支原体基因工程疫苗的研制提供了参考依据.

文章结合动物细胞培养的基本特点,介绍了国内外动物细胞培养生物反应器的研究现状以及未来的技术发展方向.

为了建立一种能在临床上快速鉴别猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)野毒和弱毒疫苗毒的检测方法,试验在对多株CSFV基因组序列比对分析后,选择特异保守区域设计2对引物构建CSFV强弱毒株双重RT-PCR方法,优化其退火温度,并检测该方法的特异性、敏感性及临床应用效果.结果 表明:试验建立的双重RT-PCR方法能从CSFV弱毒疫苗毒和临床野毒株基因组中扩增出大小分别为447 bp和343 bp的特异性基因片段;最佳退火温度为55℃;应用该方法分别对繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)弱毒疫苗毒、猪口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗毒、猪乙型脑炎病毒(JEV)弱毒疫苗毒总RNA和猪伪狂犬病毒(PRV)灭活疫苗毒、猪细小病毒(PPV)灭活疫苗毒、猪圆环病毒(PCV)灭活疫苗毒的总DNA进行检测,均未见特异性条带,特异性好;对CSFV疫苗弱毒的最低RNA检出量为6.28 ng,敏感性高;对临床混合感染病料进行检测,能同时或单独检测到CSFV强毒和CSFV弱毒疫苗毒核酸.说明试验建立的双重RT-PCR方法特异性好,敏感性高,可用于CSFV强弱毒株的检测.

为确诊贵州省某猪场发病原因,对送检病料进行细菌分离鉴定和病毒核酸检测.结果:猪繁殖与呼吸综合征病毒实时定量荧光RT-PCR核酸检测为阳性;猪圆环病毒2型PCR扩增出大小为325 bp目的基因条带;细菌分离与生化鉴定显示存在链球菌感染,且药敏试验结果表明分离菌对硫酸安普霉素、延胡索酸泰妙菌素高度敏感.实验结果诊断为猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、链球菌混合感染.