为了控制延边地区气肿疽病的发病率,制备出有效的核酸疫苗,根据NCBI上气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)的基因序列设计出一对特异性引物.将PCR扩增的CctA基因克隆到pMD19-Tsimple载体,对测序正确的基因进行序列分析,再次克隆至pcDNA3.1-1真核表达载体,并且将其转染Vero细胞.结果表明,pcDNA3.1-CctA组通过转染后的细胞存在绿色荧光的现象,同时pcDNA3.1-CctA重组质粒表达的产物大小约19 ku,说明Vero细胞中的pcDNA3.1-CctA质粒成功表达了CctA蛋白.

为了构建气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)基因真核表达载体,探讨制备安全有效气肿疽核酸疫苗的可行性,试验根据NCBI上气肿疽CctA基因序列,通过Primer Premier 5.0设计了1对特异性引物用于基因扩增,将PCR扩增的CctA基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒pMD19-T-CctA,对测序正确的基因进行序列分析后亚克隆至pVAX-1真核表达载体,并对构建的pVAX1-CctA真核表达质粒进行PCR和双酶切鉴定.结果表明:成功扩增了CctA基因目的片段,并获得了与预期大小相符的重组质粒pMD 19-T-CctA和真核表达质粒pVAX1-CctA.说明试验成功构建了气肿疽CctA基因真核表达载体.

气肿疽(Clostridium chauvoei infection)病原体为气肿疽梭菌,是一种发生于反刍动物的急性、热性、败血性传染病.常见的典型症状为发病动物肌肉丰满部位发生炎性、气性肿胀,触压有捻发音,该病的流行有一定的地方性、季节性,多发生在潮湿的山谷、牧场,且在天气炎热的多雨季节.近几年常有暴发牛气肿疽的报道,给养殖业的发展带来了巨大的冲击和经济损失,同时也逐渐地威胁到畜牧生产和人类的安全.国内关于该病的研究多数为病例报道,对于该病的详细研究和综述却是少之又少,论文参考国内外相关文献,从方法、原理、优缺点等多个方面阐述气肿疽的检测方法,以期为该病的诊断提供参考.

为建立气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)的快速检测方法,根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌ATCC10092细胞毒素CctA基因序列(登陆号:JQ692583.1)设计了一对特异性引物,并以气肿疽梭菌标准株C54-1全基因组DNA为模板,对气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因进行PCR扩增,经过敏感性和特异性试验对该试验方法进行验证,并初步应用于临床检测.结果表明:建立的PCR检测方法具有快速、特异、敏感、高效等优点,与其他诊断方法相比更适用于气肿疽梭菌的诊断.

为建立快速、准确、简便的检测气肿疽的胶体金免疫层析试纸条，以免疫层析法为指导，根据抗原－抗体的特性，建立了不需要再加入任何检测试剂且快速简便的检测方法。结果表明，胶体金与该单抗的最佳结合量为30μg／mL，最佳pH值为8．4，最佳NC膜为Millipore HFB1350220型。将纯化的气肿疽梭菌多抗及羊抗鼠IgG分别以1∶4和1∶8的稀释倍数喷于硝酸纤维素膜的T线和C线。对胶体金诊断试纸条进行验证，敏感度高，可检测到的最低抗原量为1×105 CFU／mL，特异性强、无假阳性与交叉反应现象、有较好的稳定性。本研究旨在建立快速、准确、简便的检测气肿疽的胶体金免疫层析试纸条。

本研究旨在了解吉林省延边地区气肿疽的流行情况,分别采用血涂片染色镜检法和PCR方法对延边地区4个县市的165头份牛的血液样本进行了检测,并对不同地区、不同饲养方式、不同品种、不同年龄、不同地理条件等采集的样本进行了比较.结果显示,PCR方法检测牛气肿疽的平均阳性率为15.2％(25/165),显著高于血涂片染色镜检法检测的阳性率8.5％(14/165).统计学分析表明,牛气肿疽感染率在不同地区、不同品种之间差异性不显著(P＞0.05);而不同年龄、不同地理条件气肿疽感染率差异性显著(P＜0.05);在个体农户饲养方式中的阳性率显著高于规模化养殖方式(P＜0.01),说明牛感染气肿疽受年龄、地理条件、饲养方式等因素的影响较大.本试验表明吉林省延边地区是牛气肿疽的流行地区,为当地的牛气肿疽的防控提供了理论依据.

本研究旨在对吉林省延吉市三道湾镇两位农户饲养的病死黄牛进行快速诊断.本试验采集肝脏、脾脏、心脏、肌肉等组织,通过流行病学调查、临床剖检、显微镜观察、细菌培养观察、生化试验、分子生物学试验及动物试验进行气肿疽病诊断.病死黄牛的肌肉部位触压有捻发音,切面有大量血液和气泡流出,镜检可见两端钝圆、有芽孢的大杆菌,在肝片肉汤培养基中形成上清清朗、底部有松散的白色沉淀,生化试验均呈现气肿疽厌气菌所特有的产酸产气反应,PCR扩增出大小为501 bp的特异性条带.结果表明延边地区两病死黄牛感染了气肿疽病,证明了该地区气肿疽梭菌的存在.本试验首次分离鉴定出气肿疽梭菌延边株,为该地区气肿疽病的诊断和防制提供了重要的参考依据,同时为进一步研究该病的药物防制和免疫防制奠定了重要基础.

为建立气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)的快速检测方法,根据 GenBank 中气肿疽梭菌细胞毒素 CctA 基因序列(登录号：JQ692583.1)设计了1对引物,以气肿疽梭菌标准株 C54-1全基因组 DNA 为模板,建立了牛气肿疽梭菌的 PCR 检测方法,并进行了特异性、敏感性试验。结果表明,建立的气肿疽梭菌 PCR 检测方法扩增出的片段大小为501 bp,与 GenBank 上气肿疽梭菌的同源性达99.4%,且该方法与 D 型产气荚膜梭菌、E 型产气荚膜梭菌、腐败梭菌和巴氏杆菌等病原体无交叉反应,最低检测浓度为12.30 fg/μL。结果表明,建立的 PCR 检测方法具有特异、敏感、高效等优点,与其他诊断方法相比更适用于气肿疽梭菌的诊断。

Cytotoxic CctA gene was amplified by PCR according to the GenBank Clostridium chauvoei cytotoxic CctA gene reference sequence. After cloning and sequencing, the cytotoxic CctA protein physical and chemical prop-erties, the structure and function domain, protein secondary structure and tertiary structure and antigen epitope andother important parameters were predicted and analyzed by bioinformatics methods. The result showed that com-pared to the reference sequence(JQ692583) there were three point mutations, the sequence homologies of nucleo-tides and amino acids were both 99.4%. The theoretical isoelectric point of protein was 8.00. Cytotoxic CctA proteindidnu0027t exist in the transmembrane region and signal peptide sequence. The secondary structures were mainly in be-ta-folding and random curl, and there were 4 main antigenic epitope regions. This study provided a reference for fur-ther research on cytotoxic CctA protein function, and laid the groundwork for Clostridium chauvoei monoclonal anti-bodies, synthetic peptide vaccine research and development.

气肿疽是由气肿疽梭菌引起的一种急性、热性、败血性传染病,因其具有发病快、死亡率高的特点,给畜牧业带来了巨大的的经济损失.笔者就气肿疽的发病原因进行了深入分析,并提出了加强该病防治工作的对策措施,以期有效减少和控制该病的发生,降低气肿疽病的损失程度,提高农村养殖业的经济效益.

为检测牛、羊等反刍动物的气肿疽梭菌，筛选出更为特异、敏感的PCR检测方法，分别以fliA（C）、nanA、cctA为靶基因进行 PCR 检测，并对其敏感性、特异性等方面进行比较。结果表明，以 cctA 为靶基因的 PCR 检测方法敏感性最高，最小检测 DNA 量为12．30×10－5 pg／μL；以 fliA（C）、nanA 为靶基因的 PCR 检测方法敏感性较低，最小检测 DNA量为0．123 ng／μL；3种靶基因引物菌未扩增出 D 型产气荚膜梭菌、E 型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌等基因片段，具有较好的特异性。本试验为气肿疽的快速诊断提供了更为敏感、特异的检测技术。

[Objective] To develop an indirect ELISA for detecting Clostridium chauvoei pathogen in Yanbian cattle.[Method] Clostridium chauvoei was used as antigen,ELISA detection method was established and the optimum working conditions were also determined.[Result] The optimum concentration of Clostridium chauvoei thallus antigen for coating of plate was 50 μg/ml,the dilution of serum sample was 1∶200,the working concentration of HRP-labeled rabiit anti-bovine IgG was 1∶2 000.Moreover,all the 30 bovine serum samples collected from Yanbian canton were detected by the indirect ELISA and found the positive rate was 20%.[Conclusion] The indirect ELISA method is specific and reproducible.

1选用预混料的误区 选择品牌盲目。目前市场上的预混料品种繁多,质量参差不齐。根据国家对饲料产品质量监督管理的要求,凡质量合格的产品,一是要有产品标签,标签内容包括产品名称、饲用对象、批准文号、营养成分保证值、用法、用量、净重、生产日期、厂名、

1病因分析 初生1周龄内仔猪,如果母猪乳头受到环境中病原微生物的污染,易感仔猪吸吮乳头时,病原微生物便进入仔猪的消化道。由于此时仔猪的消化道功能还未发育完全,难以抑制病原微生物在消化道内的繁殖,加上细菌毒素刺激消化道黏膜,引起肠道卡他性炎症,肠道内容物发酵后产生大量的气体,

According to the sequence of 16S rRNA gene of Clostridium chauvoei available in GenBank(Accession No.EU106373) ,two pairs of specific primers were designed and synthesized,then a nested PCR assay for rapid detection of C.chauvoei was established.Reaction conditions of the nested PCR were optimized.A specific 341bp fragment was amplified from DNA templates of C.chauvoei,but no band was amplified with templates extracted from Clostridium welchii,Pasteurella multocida or Clostridium septicum.Sensitivity of the 1st and 2nd amplifications by the nested PCR assay was 56.41pg and 56.41fg,respectively.The sensitivity of the 2nd amplifications was increased 10 3times.These results showed that this detection method had higher sensitivity and specificity,and could be used for the detection of C.chauvoei,providing a new technology for the detection in clinical cases,epidemiological investigation and import-export quarantine of emphysematous gangrene.

分离体外培养的牛源D型产气荚膜梭菌参考株菌体抗原,甲醛灭活后加弗氏佐剂免疫家兔,获得兔抗牛源D型产气荚膜梭菌多抗,并对其进行纯化,用25 nm胶体金标记多抗制备金标探针,分别以兔抗牛源D型产气荚膜梭菌IgG和羊抗兔IgG作为硝酸纤维索膜卜的检测线和质控线,组装胶体金试纸条,并对试纸条的检测效果进行评价.结果显示:试纸条操作简单,肉眼于15 min内可判定结果,对D型产气荚膜梭菌抗原具有高度特异性;试纸条在4℃保存6个月,其特异性及灵敏度没有明显变化.本研究建立的牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单快捷等特点,适合用于牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症的现场检测及鉴别诊断.