OBJECTIVES:Pathological ossification leading to spinal ankylosis is a hallmark of ankylosing spondylitis (AS), yet its molecular mechanisms remain poorly understood. We investigated the genetic basis and functional consequences of severe familial AS to identify pathways driving structural progression. METHODS:Genome-wide linkage analysis and whole-exome sequencing were performed in a multiplex family with severe AS. A heterozygous knock-in mouse carrying the identified EXTL3 variant was generated and characterized using microCT, histology, transcriptomics, primary osteoblast and chondrocyte cultures, and biochemical analyses of heparan sulfate (HS) metabolism. RESULTS:A rare missense variant in EXTL3, a key enzyme involved in HS biosynthesis, was identified in affected family members. Extl3mut/+ mice developed sacroiliac structural abnormalities, osteoid accumulation and early joint bridging, together with impaired trabecular bone architecture. Mechanistically, the mutation accelerated chondrocyte hypertrophy while delaying osteoblast maturation and mineralization. These changes were associated with activation of Wnt signalling, increased HS accumulation, enhanced heparanase expression and altered glycosaminoglycan homeostasis. Collectively, these findings identify EXTL3-mediated HS dysregulation as a novel mechanism linking abnormal bone remodelling to pathological ossification. CONCLUSIONS:Our study identifies EXTL3 as a genetic modifier of structural severity in AS and reveals a previously unrecognised role for HS metabolism in pathological ossification. These findings support a model in which HLA-B27 primarily confers disease susceptibility, whereas rare variants such as EXTL3 contribute to structural progression, highlighting HS-related pathways as potential therapeutic targets.

Background: Spondyloarthritis (SpA) is an inflammatory rheumatic disease characterized, in its axial form, by lesions affecting the spine and/or sacroiliac joints (SIJ). Severe forms of the disease manifest as exuberant ossification phenomena leading to complete ankylosis of the spine and SIJ, defining ankylosing spondylitis (AS), with underlying mechanisms not fully understood. Objectives: This study aims to advance our understanding of the pathophysiology of ossification in AS. Methods: Using whole exome sequencing analysis, we identified a mutation in the EXTL3 gene within a family exhibiting a familial form of AS. EXTL3 plays an ubiquitous role in heparan sulfate (HS) synthesis. We developed a mouse model carrying the mutation in a heterozygous state (Extl3mut/+) and conducted phenotypic exploration using micro-computed tomography (microCT) and histological analyses. Cellular and molecular pathways altered by this mutation, were investigated in primary osteoblast and chondrocyte cultures at all stages of differentiation, using transcriptomic and proteomic analyses. Results: Phenotypic analysis of 6- and 12-month-old Extl3mut/+ mice compared to wild-type Extl3+/+ mice revealed two major abnormalities at the SIJ and the spine: osteoarticular lesions and trabecular bone alterations. Osteoarticular lesions, including erosions of the sacral cortical bone, were shown in 6-month-old Extl3mut/+ mice by microCT. In 12-month-old Extl3mut/+ mice, islet formation within the iliac cortical was observed, corresponding to the inclusion of non-mineralized osteoid tissue, confirmed by histological analyses. These lesions were associated with disorganization of collagenous cartilage and chondrocyte columns, along with sacral cartilage thickening. Bridges within the SIJ space were visualized at 12 months. Trabecular bone alterations included deterioration in all parameters at 6 and 12 months, associated with an accumulation of non-mineralized osteoid tissue, defining an osteomalacia phenotype. HS accumulation was documented in both regions, primarily originating from osteoblasts. Osteoblast cultures exhibited delayed differentiation and a diminished capacity for mineralization. Furthermore, an activation of the Wnt pathway was observed, yet it appeared insufficient to rectify the observed phenotype. Conversely, chondrocyte cultures demonstrated an accelerated differentiation process toward the hypertrophic stage, associated with the activation of the Wnt pathway, suggesting a potential deregulation of endochondral ossification. Conclusion: This study identified a rare variant of the EXTL3 gene in a family with familial aggregation of AS. The murine model carrying the mutation demonstrated an articular, including cartilage lesions, and bone phenotype. A genetic association study in a large cohort of severe AS patients is underway to investigate the aggregation of rare EXTL3 variants in this population. Thus, abnormalities in the HS synthesis pathway, already implicated in multiple exostoses disease, may also contribute to the pathophysiology of ossification phenomena in AS. REFERENCES: NIL. Acknowledgements: NIL. Disclosure of Interests: None declared.

Purpose (the aim of the study): Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent joint diseases affecting million people in the world and associated to aging process as a major risk factor. OA was initially defined as a specific degenerative process of cartilage extracellular matrix (ECM), due to altered chondrocytes metabolism whose degradation products contribute to inflammation of the synovial membrane. Proteoglycans (PGs) and their glycosaminoglycan (GAG) chains, the main constituents of cartilage matrix and synovial fluid, play a major role in the structure and functional properties of these joint compartments, and are targets of such degradation.

Introduction Les phénomènes d’ossifications observés dans la spondylarthrite ankylosante (SA) ne sont pas complétement élucidés. Il existe de nombreuses données humaines et issus de modèles animaux suggérant le rôle de la voie Wnt dans l’augmentation de l’ossification endochondrale observé dans la SA. Nous avons identifié par une analyse de liaison dans une famille atteinte d’une forme familiale sévère de spondylarthrite ankylosante, un variant rare du gène EXTL3. Ce gène appartient à la famille des gènes des exostosines et est nécessaire à la synthèse des héparanes sulfates. Nous avons développé un modèle de souris porteur de la mutation Extl3. 2 phénotypes ont été identifiés chez les souris Extl3mut/+ : des lésions ostéoarticulaires de l’articulation sacro-iliaque (SI) et une altération de l’os trabéculaire au rachis et aux articulations SI. Ces anomalies sont associées à une accélération de la différenciation chondrocytaire et une désorganisation de la structure cartilagineuse de l’articulation SI, ainsi qu’une altération de la différenciation et des capacités de minéralisation ostéoblastique. L’objectif est d’étudier l’implication de la voie Wnt, ainsi que les effets de sa modulation, dans le phénotype du modèle murin Extl3 de axSpA. Matériels et méthodes Une étude immunohistochimique (IHC) a été réalisée par marquage de Tcf1 (facteur de transcription de la voie Wnt) sur les articulations SI de souris Extl3mut/+ en comparaison à des souris Extl3+/+ littermate âgées de 6 mois. In vitro, des cultures primaires ostéoblastiques et chondrocytaire ont été réalisées à différents stades de différenciation. Des expérimentations de RNASeq, qPCR et Western Blot (WB) ont été réalisées sur ces différents temps de culture. Résultats Les résultats du RNAseq montrent aux stades ultimes de différenciation chondrocytaire et ostéoblastique une forte sur-expression des inhibiteurs naturels de la voie Wnt, Dkk-1 et Sclérostine. L’étude en qPCR des cultures cellulaires aux différents stades de différenciation montrent une surexpression de différents gènes impliqués dans la voie Wnt telle que bêta-catenine, ou Tcf7. L’accélération de la différenciation chondrocytaire semble associée à des modification d’expression des acteurs Wnt 3, Wnt 4, Wnt 5a et Wnt 5b. L’étude IHC de Tcf1 sur les articulations SI de souris Extl3mut/+ âgées de 6 mois montre une nette augmentation du marquage dans les colonnes chondrocytaires et l’os sous-chondral. La surexpression de Tcf1 dans le génotype Extl3mut/+ a été confirmée en WB sur des cultures ostéoblastiques au stade terminal de différenciation (J21). Conclusion Nos résultats suggèrent que la mutation de Extl3 est associée à une altération de la signalisation Wnt à la fois dans les ostéoblastes et les chondrocytes. Ces résultats confirment des données de la littérature, issus de modèle murin ou d’étude de sérum humain. Afin de confirmer l’implication de la voie Wnt dans le phénotype observé, nous allons étudier l’impact de son inhibition in vitro dans les cultures primaires avec 3 inhibiteurs spécifiques (Dkk-1, sFRP2, PKF 118-310), ciblant différentes étapes de la voie de signalisation. Ces résultats pourraient permettre à terme d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ciblant spécifiquement les mécanismes d’ossification dans la SA.

Purpose (the aim of the study): Purpose: Osteoarthritis (OA) is the most common joint disease affecting millions of people in the world and is associated to aging. OA is characterized by a progressive degradation of the cartilage extracellular matrix (ECM), and a low-grade inflammation of the synovial membrane. To date, OA treatment have only symptomatic effects but are not efficient to limit the degradation of cartilage. Among them, intra-articular Platelet rich Plasma (PRP) injections are an autologous therapeutic option in OA.

Tissue engineering is a promising alternative to current full thickness circumferential esophageal replacement methods. The aim of our study was to develop a clinical grade Decellularized Human Esophagus (DHE) for future clinical applications. After decontamination, human esophagi from deceased donors were placed in a bioreactor and decellularized with sodium dodecyl sulfate (SDS) and ethylendiaminetetraacetic acid (EDTA) for 3 days. The esophagi were then rinsed in sterile water and SDS was eliminated by filtration on an activated charcoal cartridge for 3 days. DNA was removed by a 3-hour incubation with DNase. A cryopreservation protocol was evaluated at the end of the process to create a DHE cryobank. The decellularization was efficient as no cells and nuclei were observed in the DHE. Sterility of the esophagi was obtained at the end of the process. The general structure of the DHE was preserved according to immunohistochemical and scanning electron microscopy images. SDS was efficiently removed, confirmed by a colorimetric dosage, lack of cytotoxicity on Balb/3T3 cells and mesenchymal stromal cell long term culture. Furthermore, DHE did not induce lymphocyte proliferation in-vitro. The cryopreservation protocol was safe and did not affect the tissue, preserving the biomechanical properties of the DHE. Our decellularization protocol allowed to develop the first clinical grade human decellularized and cryopreserved esophagus.

Supplementary Figures 1-5, Tables 1-2, and Methods and Materials from A Simple Approach to Cancer Therapy Afforded by Multivalent Pseudopeptides That Target Cell-Surface Nucleoproteins

Hematopoiesis support by MSCs in LTBMC BFU-E, CFU-G, CFU-M and CFU-GM by PMF (n=3) and healthy donors (HD, n=3) expressed as number of colonies for 104 bone marrow mononuclear cells.

Les glycosaminoglycanes (GAG) sont des polysaccharides linéaires sulfatés associés à des cores protéiques pour former des protéoglycans. Ils sont présents dans la matrice extracellulaire (MEC) du cartilage et dans le liquide synovial (LS) et participent à la régulation de nombreux processus physiopathologiques. Alors que les quantités, structures chimiques et fonctions cellulaires des GAG évoluent au cours de l’arthrose (OA), il existe très peu d’informations sur ces GAG dans la polyarthrite rhumatoïde (PR). Notre étude a pour objectifs de comparer les caractéristiques quantitatives, structurales et fonctionnelles des GAG du LS de patients atteints de PR ou d’OA et de rechercher des corrélations entre ces signatures glycaniques et les données cliniques, biologiques ou radiographiques des patients. Les GAG ont été purifiés à partir de LS collectés dans la cohorte BIOGO, incluant des patients présentant une gonarthrose, ou une arthrite dans le cadre d’une PR. Des cultures de synoviocytes ont été réalisées à partir de LS de patients OA. Les GAG de LS ont été quantifiés par DMMB. L’affinité des GAG pour des Heparin-Binding Protein (HBP) a été analysée par des tests ELISA compétitifs. Enfin, l’impact des GAG sur le phénotype inflammatoire de synoviocytes a été évalué par dosage ELISA de la sécrétion d’IL-6 et d’IL-8. La concentration médiane en GAG dans les LS PR (n = 5) et OA (n = 15) était similaire (26,4 vs 24,2 μg/mL). Elle n’était pas associée à l’âge (p = 0,58) ou à l’IMC (p = 0,58), mais était significativement plus importante chez les hommes que chez les femmes (p = 0,03). Chez les patients PR, elle n’était pas associée à la CRP seule (p = 0,11), mais était très significativement corrélée à l’activité clinique de la maladie mesurée par le DAS 28 CRP (p = 0,0001). Le taux de GAG dans le LS semblait également plus important chez les patients ayant une PR débutante. Chez les patients OA, elle n’était pas associée à la sévérité clinique (p = 0,56) ou radiographique (p = 0,46). Sur le plan fonctionnel, les GAG de LS PR et OA interagissaient avec le VEGF, le FGF2 et le PDGFBB, mais avec une affinité relativement faible par rapport à celle de l’héparine et sans différence entre les GAG OA et PR. Enfin, les GAG de LS PR induisaient une sécrétion d’IL-6 par les synoviocytes significativement plus élevée (×2) que les GAG OA. S’il n’y a pas de différence quantitative des taux de GAG dans les LS de PR et d’OA, les GAG synoviaux de PR sont corrélés à l’activité de la maladie et pourraient avoir un effet spécifique de modulation du phénotype inflammatoire. Même si ces résultats restent à confirmer, ils pourraient s’expliquer par des spécificités structurales des GAG au cours de la PR (sulfatations des GAG). En revanche, la concentration en GAG des LS OA n’était pas associée à la sévérité radio-clinique de l’OA. Ainsi, ces données confirment l’intérêt de préciser le rôle des GAG dans les maladies ostéoarticulaires pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques de type glycanique.

Les injections intra-articulaires de plasma riche en plaquettes (PRP) sont en plein essor dans les pathologies musculosquelettiques, particulièrement dans la gonarthrose. Leur effet est principalement attribué aux facteurs de croissances (FC) et cytokines libérés par les plaquettes. La plupart de ces facteurs sont dits Heparin-Binding (FHB) car ils peuvent lier des éléments matriciels d’origine glycanique, les glycosaminoglycanes (GAG). Ces polysaccharides linéaires complexes sont classés en quatre familles, dont les Héparanes Sulfates (HS). Les HS ont des capacités spécifiques à interagir et réguler les FHB, liées à la complexité de leur structure chimique, en particulier à leur profil de sulfatation, évolutif au cours de l’âge ou de processus physiopathologiques. Des études préliminaires suggèrent que l’activité anabolique sur les tissus articulaires du PRP provenant de sujets âgés et arthrosiques serait réduite par rapport au PRP du sujet jeune et sain. Notre hypothèse est que la composition en GAG du PRP, ainsi que leur capacité d’interaction avec les FHB, pourraient influencer l’effet thérapeutique du PRP. Notre objectif principal était de comparer les caractéristiques structurales et fonctionnelles des GAG de PRP de donneurs sains (PRP CT) et arthrosiques (PRP A). Les PRP CT ont été obtenus par dons de sang provenant de l’Établissement français du sang. Les PRP A étaient issus de patients présentant une gonarthrose symptomatique inclus dans la cohorte monocentrique BIOGO (CHU Henri Mondor). Tous les PRP ont été préparés à partir du kit RegenBCT®, et caractérisés par la mesure de leurs concentrations en FC (FGF2, VEGF et PTN) et cytokines (IL6, IL8 et IL1ß) par des kits de dosage Elisa. Les GAG totaux ont été extraits et quantifiés par test DMMB. Les longueurs des chaînes de GAG totaux et des HS ont été comparées entre les groupes par migration sur gel d’acrylamide. Des tests de liaisons compétitives ont permis d’exprimer l’IC50 des GAG pour le FGF2, PDGFbb, VEGF et PTN, correspondant à la concentration nécessaire à l’inhibition de 50% de la liaison de ces FC à l’héparine immobilisée. Quarante-cinq PRP CT et 21 PRP A ont été étudiés. Les concentrations d’IL8 et de FGF2 étaient augmentées dans le PRP A (IL8 : 22,3 ± 18,9 pg/mL vs 3,6 ± 3,3 pg/mL pour les PRP CT ; p < 0,05 ; FGF2 : 18,1 ± 11,6 pg/mL vs 8,5 ± 5,3 pg/mL ; p < 0,01). De même, la concentration de GAG totaux était plus importante dans les PRP A (7,5 ± 4,3 μg/mL vs 2,9 ± 1,6 μg/mL de PRP CT ; p < 0,0001), sans qu’aucune corrélation significative ne soit trouvée avec les données démographiques (âge et sexe). Les profils de migrations des GAG sur gel étaient qualitativement différents entre les groupes. L’affinité des GAG de PRP A était 20 fois plus forte pour PTN (IC50 = 231 ± 143 μg/mL vs 5540 ± 4870 μg/mL de PRP CT ; p < 0,01). Notre étude confirme la présence de GAG dans les PRP, mais également l’existence de différences quantitatives, structurales et fonctionnelles entre les GAG de PRP CT et de PRP A. L’impact fonctionnel de celles-ci devra être évalué sur les métabolismes chondrocytaire et synoviocytaire, afin d’identifier si les effets thérapeutiques du PRP peuvent être modulés voir médiés par leur composante glycanique.

La matrice extracellulaire a longtemps été considérée comme un « simple » tissu de soutien des cellules, produisant des forces de tension permettant leur adhésion et les protégeant contre le stress mécanique, en particulier dans le cartilage. Pourtant, un grand nombre des constituants matriciels subissent des modifications structurales très dynamiques, impactant de façon notable les propriétés qu’ils confèrent à l’environnement mais aussi aux cellules. C’est le cas des glycosaminoglycannes, polysaccharides linéaires sulfatés et complexes, présents dans toutes les matrices, mais particulièrement enrichis dans le cartilage, sous la forme de chondroïtines sulfates et d’acide hyaluronique. L’arthrose est encore actuellement principalement identifiée comme une pathologie dégénérative de la matrice cartilagineuse liée à l’usure de l’âge. Mais d’autres phénotypes sont à présent caractérisés et permettent de mieux comprendre les processus physiopathologiques complexes de cette pathologie qui affectent l’ensemble des tissus de l’articulation. Alors que les traitements en cours, visant à combler les déficits en composés matriciels ou à bloquer les activités cataboliques des chondrocytes, ne paraissent plus suffisants pour réparer le cartilage, nous reviendrons dans cet article à la source « glycanique » des composés de la matrice cartilagineuse et à leur rôle dans les processus physiopathologiques de l’arthrose, pour identifier de nouvelles voies de recherches et produits thérapeutiques en devenir.

La spondyloarthrite est un rhumatisme inflammatoire caractérisée notamment par une atteinte du rachis et des articulations sacro-iliaques (SI). Les formes sévères de cette pathologie se définissent par l’apparition de phénomène d’ossification exubérante pouvant aboutir à une ankylose complète du rachis et des SI définissant la spondylarthrite ankylosante (SA). Les mécanismes physiopathologiques de ces ossifications sont incomplètement élucidés. L’objectif de cette étude est de progresser sur la physiopathologie de l’ossification dans la SA. À partir d’une famille présentant une forme familiale de SA, nous avons identifié une mutation du gène EXTL3, impliqué dans la synthèse des héparanes sulfates (HS). Nous avons construit un modèle murin porteur de la mutation, et avons réalisé des analyses phénotypiques de ce modèle par microCT et coupes histologiques. Les modifications cellulaires et moléculaires induites par cette mutation et associés aux phénotypes observés, ont été explorées par des cultures primaires ostéoblastiques et chondrocytaires à tous les stades de différenciation avec des analyses transcriptomique et protéique. L’analyse phénotypique a porté sur des souris hétérozygotes pour la mutation Extl3mut/+ âgées de 6 et 12 mois en comparaison à des souris sauvages Extl3+/+ aux mêmes âges. Au 2 temps d’évaluation, nous avons pu observer 2 phénotypes distincts aux articulations SI et au rachis chez nos souris Extl3mut/+ : des lésions ostéoarticulaires et une altération de l’os trabéculaire. Les lésions ostéoarticulaires, caractérisées notamment par des érosions de la corticale sacrée, ont été confirmées en microCT par la réalisation d’un scoring en double insu chez les souris Extl3mut/+ âgées de 6 mois. Au plan histologique, nous avons pu aussi observer la formation d’îlots au sein de la corticale correspondant à des inclusions de tissu ostéoïde non minéralisé. Ces lésions sont associées à une désorganisation de la structure cartilagineuse collagènique et des colonnes chondrocytaires, avec un épaississement du cartilage sacré. L’altération de l’os trabéculaire se caractérise par une altération de tous les paramètres osseux trabéculaires à 6 et 12 mois. Ce phénotype est associé à une accumulation de tissu ostéoïde non minéralisé dans les régions péri-trabéculaire et sous chondrale, sans modification du volume osseux total définissant un phénotype ostéomalacique. Une accumulation d’HS est documentée dans ces deux régions. Les cultures chondrocytaires ont montré une nette accélération de la différenciation vers le stade hypertrophique, associée à une activation de la voie Wnt. Les cultures ostéoblastiques ont révélé un retard de différenciation et une diminution des capacités de minéralisation. Cette étude nous a permis d’identifier un variant rare du gène EXTL3 à partir d’une famille avec agrégation familiale de SA. L’étude du modèle murin porteur de la mutation conduit à des lésions articulaires et osseuses évoquant des anomalies de l’ossification endochondrale. Une étude d’association génétique est en cours dans la cohorte Bamboo Spine afin de rechercher une agrégation de variants rares d’EXTL3 dans cette population de SpA sévère. Ainsi, des anomalies de la voie de synthèse des héparanes sulfates, déjà impliquées dans la maladie des exostoses multiples, pourraient également être impliquées dans la physiopathologie des phénomènes d’ossification de la SA.

As a first line of defense, small airways homeostasis is critical to lung functionality. Pathological changes of the cellular and ECM components in the small airways are often seen in chronic respiratory diseases such as COPD. Mechanistic understanding of these changes is key to developing novel therapies. Recent efforts within the Human Lung Cell Atlas using single cell transcriptomics revealed the cellular landscape of healthy and diseased lungs, yet the associated spatial context and proteomic information remained elusive. Here, we address this knowledge gap with spatially-resolved proteomics, using a combination of laser-capture microdissection and state-of-the-art mass spectrometry. We characterized 62 distinct regions with stereotypical histopathological patterns of control donors* (n=2) and patients with chronic lung diseases* (COPD, n=2; IPF, n=2). We microdissected regions along the distal airways (terminal and respiratory bronchioles and alveoli), vasculature (pulmonary arteries, veins and micro vessels), as well as pathological patterns associated with these structures in COPD and IPF. We identified regions enriched in disease-specific cell populations, such as the aberrant basaloid cells in histopathologically staged IPF samples, and characterized the associated ECM niche. We used cell type and state signatures from an integrated single cell atlas of chronic lung disease and identified regional enrichments for specific cell states in the niche proteomes. In summary, a spatially-resolved proteomics workflow enables correlation of local cell states to the ECM niche signal, providing insights into uncovered instructive tissue niches in the distal human lung. *: after informed consent

Purpose: Among extracellular matrix (ECM) compound remodeled during OA ., Glycosaminoglycan (GAG) are of specific interest according to the abundant composition and structural roles of Chondroitin Sulfate (CS), Keratan sulfate (KS) and Hyaluronic Acid (HA) in different compartment of the joint. Moreover, recent studies have highlighted the role of rare Heparan Sulfates (HS) and enzymes involved in their biosynthesis, in cartilage homeostasis. HS are of interest according to their ability to interact with and potentiate the activity of “Heparin Binding Proteins” (HBP) such as Growth factors, interleukins, chemokines, or enzymes that act as important cellular regulators.

Les glycosaminoglycannes (GAGs), chaines linéaires constituées de structures disaccharidiques répétées, sont présents dans le liquide synovial (LS) arthrosique par dégradation des protéoglycans (PGs) et sont capables via leurs domaines sulfatés de se lier aux Heparin Binding Protein (HBP), dont font partie la plupart des facteurs de croissance et les cytokines et ainsi d’en moduler leurs effets. Nous avons préalablement mis en évidence des modifications structurelles des GAGs du cartilage arthrosique et du LS arthrosique, en particulier des héparanes sulfates (HS), et un effet procatabolique de ceux-ci sur des chondrocytes en culture. L’objectif de ce travail était d’étudier l’impact des GAGs du LS arthrosiques sur des synoviocytes fibroblastiques humains (FLS) arthrosiques. Les GAGs ont été extraits et quantifiés à partir de LS collectés chez des patients présentant une gonarthrose débutante à sévère prélevés dans le cadre des soins courants (ponction diagnostique ou infiltration). Parallèlement, des cultures de FLS ont été réalisées à partir de membranes synoviales (MS) ou de LS de patients arthrosiques. L’impact fonctionnel des GAGs de LS (0,025 μg/mL, 0,25 μg/mL ou 2,5 μg/mL) sur les FLS a été analysé à la fois sur le plan de la prolifération cellulaire par test de viabilité au prestoBlue et sur leur profil de sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et IL-8), dosées par ELISA. Leurs effets fonctionnels sur les FLS ont également été étudiés en association aux HBP [TGF-β (20 ng/mL pour l’étude de la prolifération et 5 ng/mL pour l’étude de la sécrétion d’IL-6 et d’IL-8), IL-1β (0,1 ng/mL pour l’étude de la prolifération et 1 ng/mL pour l’étude de la sécrétion d’IL-6 et d’IL-8), FGF-2 (5 ng/mL) et FGF-18 (10 ng/mL)]. Notre étude a été effectuée à partir des GAGs de 11 LS arthrosiques et sur des cultures de FLS obtenus chez 5 patients (4 MS et 1 LS). La stimulation des FLS par les GAGs de LS arthrosiques inhibait leur prolifération de l’ordre de 20 % (p < 0,05). De plus, l’ajout de GAGs (0,025 μg/mL, 0,25 μg/mL et 2,5 μg/mL) diminuait de l’ordre de 50 % l’effet prolifératif du TGF-β et inhibait complètement celui de l’IL-1β (p < 0,05). Cette inhibition n’était pas observée sur l’effet mitogène du FGF-2. Aucun effet du FGF-18 seul ou en association aux GAG de LS n’a été mis en évidence sur la prolifération des FLS. Si les GAGs seuls n’avaient pas d’influence sur la sécrétion d’IL-6 et d’IL-8 par les FLS arthrosiques, la stimulation par les GAGs (2,5 μg/mL) potentialisait la sécrétion d’IL-6 induite par le TGF-β seul (1027 ± 294 pg/mL contre 763 ± 159 pg/mL, p < 0,05). De même, un effet synergique des GAGs (2,5 μg/mL) en association avec le FGF-18 était observée sur la sécrétion d’IL-6 par les FLS arthrosique (230 ± 300 pg/mL contre 200 ± 250 pg/mL pour FGF-18 seul, p < 0,05). Les GAGs n’avaient aucune influence sur la sécrétion d’IL-6 et IL-8 induite par l’IL-1β. Nous avons mis en évidence pour la première fois que les GAG extraits et purifiés à partir de LS arthrosiques pouvaient moduler l’effet des HBP, en particulier en inhibant la prolifération synoviocytaire et en induisant la sécrétion de certaines cytokines pro-inflammatoires. Reste à caractériser les rôles fonctionnels respectifs des différents GAGs et en particulier des héparanes sulfates.

Proteomics has exposed a plethora of posttranslational modifications, but demonstrating functional relevance requires new approaches. Top-down proteomics of intact proteins has the potential to fully characterize protein modifications in terms of amount, site(s), and the order in which they are deposited on the protein; information that so far has been elusive to extract by shotgun proteomics. Data acquisition and analysis of intact multimodified proteins have however been a major challenge, in particular for positional isomers that carry the same number of modifications at different sites. Solutions were previously proposed to extract this information from fragmentation spectra, but these have so far mainly been limited to peptides and have entailed a large degree of manual interpretation. Here, we apply high-resolution Orbitrap fusion top-down analyses in combination with bioinformatics approaches to attempt to characterize multiple modified proteins and quantify positional isomers. Automated covalent fragment ion type definition, detection of mass precision and accuracy, and extensive use of replicate spectra increase sequence coverage and drive down false fragment assignments from 10% to 1.5%. Such improved performance in fragment assignment is key to localize and quantify modifications from fragment spectra. The method is tested by investigating positional isomers of Ubiquitin mixed in known concentrations, which results in quantification of high ratios at very low standard errors of the mean (<5%), as well as with synthetic phosphorylated peptides. Application to multiphosphorylated Bora provides an estimation of the so far unknown stoichiometry of the known set of phosphosites and uncovers new sites from hyperphosphorylated Bora.