Objective To perform methodological validation of non-reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate(nrCE-SDS)for monoclonal antibodies,providing a reference for the methodological validation of corresponding quality control methods in the industry.Methods Samples were analyzed according to the general chapter<3127>determination method for monoclonal antibody molecular size variants in the Pharmacopoeia of the People's Republic of China(2020 edition).Two laboratory technicians performed experiments over three days,using the same detection method daily to analyze the test samples,alongside comprehensive methodological validation.Results The method demonstrated good specificity,with the accuracy of the main peaks of all analytical samples reaching 98% to 102%,and the accuracy of total fragments and specific impurities reaching 70% to 130% .The relative standard deviation(RSD)for repeatability and intermediate precision was≤15% .The ranges for the main peak,total fragment,and specific impurity were≥89.9%,0.66% to 10.10%,and 0.36% to 4.80%,respectively.The limit of quantification of the method was 0.33% .Conclusion Full validation demonstrates good accuracy,precision,linearity,range,limit of quantification,and specificity of the method,providing a reference for the scientific and rational design of corresponding methodological validations.
目的 在外泌体表面表达肝癌靶向肽SP94,并将生长分化因子15(GDF15)的siRNA包裹至外泌体中,研究其对肝癌的治疗作用.方法 首先设计合成GDF15的siRNA,转染Hepa1-6和H22细胞作为实验组,无靶向的siRNA作为对照组,通过实时定量PCR、蛋白免疫印迹和流式细胞术验证GDF15 siRNA的功能.再构建一个靶向肝癌的SP94-Lamp2b-HA质粒,转染入HEK293T细胞后提取工程化外泌体SP94-外泌体,用SP94-外泌体包裹GDF15 siRNA作为SP94-siRNA-外泌体实验组,空载S P94-外泌体作为空载对照组,通过尾静脉注射法将两组外泌体导入小鼠体内,研究小鼠原位肝癌模型的治疗效果,并对小鼠的生存期进行观察.另外,将SP94-siRNA-外泌体尾静脉注射入健康小鼠体内,观察器官变化情况,对比血液生物化学和炎性因子指标差异.结果 成功合成GDF15 siRNA,在转染Hepa1-6和H22细胞后,GDF15的mRNA和蛋白水平表达明显降低(P<0.05).在对原位肝癌小鼠的治疗中,与对照组相比,实验组SP94-siRNA-外泌体明显抑制肿瘤的增长(P<0.05),同时延长小鼠的生存期.实验组与对照组小鼠器官、血液生物化学和炎性因子指标无明显差异(P>0.05),表明SP94-siRNA-外泌体对小鼠基本无毒副作用.结论 SP94-siRNA-外泌体可以精准靶向肝癌,并有效地抑制肝癌的生长.
目的 探讨精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)依赖的中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)在包虫囊液所致过敏性休克(AS)中的作用和相关机制.方法 将野生型(WT)和PAD4 敲除(PAD4-/-)的C57/B6 小鼠分为 4 组:WT组、WT模型组、PAD4-/-组和PAD4-/-模型组,每组 10 只.WT模型组和PAD4-/-模型组腹腔注射包虫囊液建立包虫感染小鼠模型.1 个月后,两个模型组小鼠再次注射包虫囊液,监测各组小鼠休克和死亡情况.采用qRT-PCR检测各组小鼠脾脏中中性粒细胞PAD4 mRNA表达水平,采用绿菁染色法检测各组小鼠脾脏NETs形成水平,采用流式细胞术检测各组小鼠外周血单核细胞(PBMC)中Th1/Th2 细胞比例,采用ELISA检测各组小鼠血清中IL-4、IL-5 和IgE 水平.体外将 NETs 与小鼠 PBMC 共孵育,分为对照组和NETs组,采用流式细胞术检测各组细胞中Th1/Th2 细胞比例,ELISA检测各组细胞上清中IL-4、IL-5 和IgE水平.结果 与WT组比较,WT模型组小鼠休克率和死亡率升高,脾脏中中性粒细胞PAD4 mRNA表达和NETs形成水平升高(P＜0.05),PBMC中Th1/Th2 细胞比例降低(P＜0.05),IL-4、IL-5 和IgE水平升高(P＜0.05).与WT模型组比较,PAD4-/-模型组小鼠休克率和死亡率降低,脾脏中中性粒细胞PAD4 mRNA表达和NETs形成水平降低(P＜0.05),PBMC中Th1/Th2 细胞比例升高(P＜0.05),IL-4、IL-5 和IgE水平降低(P＜0.05).与PAD4-/-组比较,PAD4-/-模型组小鼠脾脏中中性粒细胞PAD4 mRNA表达和NETs形成水平、PBMC中Th1/Th2 细胞比例以及IL-4、IL-5 和IgE 水平无显著性差异(P＞0.05).与对照组比较,NETs 组Th1/Th2 细胞比例降低(P＜0.05),上清中IL-4、IL-5 和IgE水平升高(P＜0.05).结论 包虫囊液感染可诱导PAD4 依赖的NETs形成,加重小鼠过敏性休克.敲除PAD4 可抑制NETs形成,并通过恢复失衡的Th1/Th2 细胞比例最终缓解包虫囊液所致的过敏性休克.
目的 研究沉默信息调节因子2 相关酶类7(silent information regulator 2 related enzyme 7,SIRT7)对低氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs)增殖和迁移的调控作用,并探讨可能的分子作用机制.方法 体外培养HPASMCs建立低氧模型.通过慢病毒介导的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默SIRT7在HPASMCs中的表达.实验分为4 组:常氧对照组、低氧组、低氧+LV-sh-Ctrl组和低氧+LV-sh-SIRT7 组.低氧+LV-sh-Ctrl组HPASMCs感染对照重组腺病毒LV-sh-Ctrl,然后进行低氧处理.低氧+LV-sh-SIRT7 组HPASMCs感染表达SIRT7 shRNA的重组腺病毒LV-sh-SIRT7,然后进行低氧处理.采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测SIRT7 的mRNA表达水平.采用Western blotting检测SIRT7、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、转化生长因子β受体Ⅰ(transforming growth factor-βreceptorⅠ,TβRⅠ)、Smad2 和Smad3 的蛋白表达量.采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)实验检测细胞增殖.采用流式细胞术检测细胞凋亡.采用Transwell实验检测细胞迁移.结果 与常氧对照组比较,低氧组和低氧+LV-sh-Ctrl组SIRT7 表达水平显著升高(P＜0.01),细胞增殖和迁移水平显著提高(P＜0.01),细胞凋亡率显著降低(P＜0.05);与低氧组和低氧+LV-sh-Ctrl组比较,低氧+LV-sh-SIRT7 组SIRT7 表达水平显著降低(P＜0.01),细胞增殖和迁移水平显著下降(P＜0.01),细胞凋亡率显著增加(P＜0.01).与常氧对照组比较,低氧组和低氧+LV-sh-Ctrl组TGF-β1、TβRⅠ、p-Smad2 和p-Smad3 的蛋白表达量显著增加(P＜0.01);与低氧组和低氧+LV-sh-Ctrl组比较,低氧+LV-sh-SIRT7 组TGF-β1、TβRⅠ、p-Smad2 和p-Smad3 的蛋白表达量显著减少(P＜0.01).结论 基因沉默SIRT7 通过调控TGF-β1/Smad信号通路抑制缺氧诱导的HPASMCs增殖和迁移.
目的 基于细胞因子芯片探究白蛋白结合型紫杉醇(nanoparticle albumin-bound paclitaxel,Nab-PTX)诱导化疗相关周围神经病变(chemotherapy-induced peripheral neuropathy,CIPN)的分子机制.方法 建立CIPN大鼠模型,将8 只清洁级雄性SD大鼠随机均分为实验组和对照组,实验组大鼠第 1,3,5,7 天腹腔注射Nab-PTX(10 mg/kg),对照组大鼠第 1,3,5,7 天腹腔注射同等体积生理盐水,期间观察两组大鼠状态、饮食及粪便情况,第 7 天分别检测实验组和对照组大鼠疼痛阈值并确定造模成功.实验第9 天将两组大鼠经水合氯醛麻醉后处死,取大鼠L4-6 脊髓进行细胞因子芯片检测,筛选实验组和对照组表达显著差异的蛋白;并对差异蛋白进行基因本体分析(gene ontology,GO)及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析.结果 细胞因子芯片共筛选出5 个表达显著差异的蛋白:Fractalkine、Gas1、RANTES、Notch-1、Prolactin,且这5 个差异蛋白在实验组表达水平均显著高于对照组(P＜0.05).GO分析显示,这 5 个差异蛋白主要参与调控细胞因子及其受体活性、上皮细胞增殖.KEGG通路富集结果显示,这些差异蛋白主要富集于细胞因子受体相关通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等.结论 细胞因子Fractalkine、Gas1、RANTES、Notch-1、Prolactin是Nab-PTX作用的关键靶点;Nab-PTX通过调控神经上皮细胞增殖、细胞因子及其受体活性、细胞因子受体相关通路及TNF信号通路等引起CIPN.
目的 探讨长链非编码RNA核内富集转录物 1(NEAT1)对人宫颈癌细胞(HeLa)增殖、凋亡、侵袭和转移的影响,并探讨其与miR-34a-5 p的关系.方法 采用实时定量PCR检测NEAT1、miR-34a-5 p 在HeLa和EEC 细胞中的表达.筛选siRNA-NEAT1 干扰序列,将HeLa细胞分为阴性对照组及siRNA-NEAT1 转染组,采用CCK-8 法检测细胞增殖,Transwell法及划痕实验检测细胞迁移,Transwell 法检测细胞侵袭,流式细胞术检测细胞凋亡.最后利用双荧光素酶报告基因试验验证NEAT1 与miR-34a-5 p的靶向关系.结果 与EEC细胞相比,HeLa细胞中NEAT1 mRNA表达增强(P＜0.05),miR-34a-5 p mRNA表达降低(P＜0.05).与阴性对照组相比,siRNA-NEAT1 转染组 HeLa细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显降低(P＜0.05),细胞凋亡明显增加(P＜0.05).与NEAT1-WT+miR-NC组相比,NEAT1-WT+miR-34a-5p mimics组的荧光素酶表达降低(P＜0.05);而与NEAT1-MUT+miR-NC组相比,NEAT1-MUT+miR-34a-5p mimics组的荧光素酶表达不变(P＞0.05).结论 NEAT1 靶向miR-34a-5 p参与调控HeLa细胞功能,提示NEAT1 通过调控miR-34a-5 p参与宫颈癌的发生.
目的 探究丙泊酚对脂多糖(LPS)诱导的人肝癌细胞增殖、凋亡、迁移、炎症因子的影响及其机制.方法 体外培养人肝癌MHCC97H细胞系,分为对照组、LPS组、丙泊酚低剂量组、中剂量组、高剂量组和中剂量+BAY 11-7082 组.对照组细胞不做干预,LPS组以 1 μg/ml LPS处理,低剂量组、中剂量组、高剂量组分别以 1 μg/ml LPS和 12.5,25,50 μmol/L丙泊酚同时给药处理,中剂量+BAY 11-7082 组以 1 μg/ml LPS、25 μmol/L丙泊酚和 10 μmol/L NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082 同时给药共培养处理,均干预24 h.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达,活细胞计数(CCK-8)检测细胞活力,5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)检测细胞增殖,Hoechst 33258 染色法检测细胞凋亡,Transwell小室检测细胞迁移能力,蛋白免疫印迹(WB)法检测细胞周期素D1(Cyclin D1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、IKKα、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白水平.结果 与对照组相比,LPS组细胞炎症因子TNF-α表达水平和细胞活力显著升高(P＜0.05);与LPS组相比,中剂量组和高剂量组炎症因子TNF-α表达水平和细胞活力显著降低(P＜0.05),其中高剂量组细胞活力较低,故选择中剂量 25 μmol/L 丙泊酚进行后续实验.与对照组相比,LPS 组细胞增殖率、迁移数及 Cyclin D1、IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65 蛋白表达显著升高,细胞凋亡率和Caspase-3 蛋白表达显著降低(均P＜0.05);与LPS组相比,中剂量组细胞增殖率、迁移数及Cyclin D1、IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65 蛋白表达显著降低(P＜0.05),细胞凋亡率和Caspase-3蛋白表达显著升高(P＜0.05);与中剂量组比较,中剂量+BAY 11-7082 组细胞增殖率、迁移数及Cyclin D1、IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65 蛋白表达显著降低(P＜0.05),细胞凋亡率和Caspase-3 蛋白表达显著升高(P＜0.05).结论 丙泊酚可显著抑制LPS诱导的人肝癌MHCC97H细胞的炎症、增殖及迁移,诱导MHCC97H细胞凋亡,其作用机制可能与抑制NF-κB通路的信号转导相关.
膀胱癌是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤,其发病率在全球各地有所差异,但总体呈上升趋势.膀胱癌的组织学类型多样,其中以尿路上皮癌最为常见,占90％以上[1].尿路上皮癌又可分为移行细胞癌、鳞状细胞癌和腺癌等亚型[2].
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病变呈连续性,可累及结直肠黏膜层及黏膜下层的慢性特发性炎症性疾病.其发病涉及遗传、免疫、肠道菌群等.临床常见表现为腹痛、里急后重、黏液脓血便.西医治疗药物包括糖皮质激素、皮质类固醇、免疫抑制剂等,虽然取得一定的疗效,但仍有复发率高、副作用较大等问题.UC归属于祖国医学"肠风""肠辟""下痢""泄泻"等范畴,中医通过辨证论治,使用中药对症加减治疗,在临床及实验中均取得较好疗效.
目的 考察L-白雀木醇(L-quebrachitol,L-Q)对骨折愈合的促进作用及其对Wnt/β-catenin信号通路的影响.方法 将40 只大鼠随机分为对照组(1%DMSO)和白雀木醇组[L-Q,30 mg/(kg·d)白雀木醇],每组20 只,给药4 周后对大鼠进行安全性评价.构建胫骨骨折大鼠模型,然后将36 只胫骨骨折模型大鼠随机分为3 组:模型组(1%DMSO)、10 mg/(kg·d)L-白雀木醇组(10L-Q组)和30 mg/(kg·d)L-白雀木醇组(30L-Q组),每组 12 只.给药 3 周后,对各组大鼠进行X线检查和Mirco-CT分析及骨痂组织番红O-固绿染色.通过qRT-PCR或 Western blot检测骨痂组织中骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子-2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的表达.结果 对照组和L-Q组大鼠的外观和行为、体质量和摄食量、血液学指标、血清生化指标、脏器系数无显著差异(P＞0.05).与模型组相比,10L-Q组和30L-Q组大鼠的骨痂内新生骨小梁和成骨分化明显增多,伴随骨痂跨越骨折端和编织骨替代软骨细胞.与模型组相比,10L-Q组和 30L-Q组大鼠骨痂组织中OCN、OPN、Runx2、ALP和BMP-2 的mRNA相对表达水平均升高(P＜0.05).与模型组相比,10L-Q组和 30L-Q组大鼠骨痂组织中Wnt-3a、Wnt-5 a和β-catenin的mRNA和蛋白相对表达水平均升高(P＜0.05),GSK-3β的mRNA和蛋白相对表达水平均降低(P＜0.05).结论 L-白雀木醇可促进胫骨骨折大鼠骨折愈合,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关.
目的 探究银屑病皮损及健康人皮肤间充质干细胞(dermal mesenchymal stem cells,DMSCs)来源外泌体(exosomes,EXO)对外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)分泌细胞因子的影响.方法 分离培养健康人皮肤组织及银屑病患者皮损处的间充质干细胞分泌的外泌体(DMSC-derived exosomes,DMSCs-EXO),从健康志愿者及银屑病患者外周血中分离培养PBMCs,分别加入不同来源的外泌体,于0,24,72 h收集上清液.ELISA法测定相关炎症因子IL-17、IL-23、IL-10 和TGF-β1.结果 ELISA结果显示,银屑病患者皮损处的间充质干细胞分泌来源的外泌体(psoriasis DMSC-derived exosomes,PDMSCs-EXO)干预后,健康人PBMCs中IL-17、IL-23 上调(P＜0.05),IL-10、TGF-β1 下调(P＜0.05);健康人皮肤处的间充质干细胞分泌来源的外泌体(healthy DMSC-derived exosomes,HDMSCs-EXO)干预后,银屑病患者PBMCs中IL-10、TGF-β1 上调(P＜0.05),IL-17、IL-23 下调(P＜0.05).干预后 24h及 72h时,健康人PBMCs+PDMSCs-EXO组IL-17、IL-23 高于健康人PBMCs+HDMSCs-EXO组(P＜0.05),IL-10、TGF-β1 低于健康人PBMCs+HDMSCs-EXO组(P＜0.05);干预后24h及72 h,银屑病患者PBMCs+HDMSCs-EXO组IL-17、IL-23 低于银屑病患者PBMCs+PDMSCs-EXO组(P＜0.05),干预后 24 h,IL-10、TGF-β1 高于银屑病患者PBMCs+PDMSCs-EXO组(P＜0.05).与银屑病患者PBMCs+PDMSCs-EXO组相比,健康人PBMCs+PDMSCs-EXO组在24h时,IL-23、IL-17 及TGF-β1 无明显差异,在 72h时TGF-β1 无明显差异;与健康人PBMCs+HDMSCS-EXO组相比,银屑病患者PBMCs+HDMSCS-EXO组在 72h时IL-23 和IL-17 水平无明显差异.结论 PDMSCs-EXO可能影响PBMCs分泌促炎细胞因子并抑制抗炎细胞因子,同时HDMSCs-EXO参与调节细胞因子失衡引起的炎症反应.
目的 探讨miR-491-5p对乳腺癌增殖及侵袭的影响及相关机制.方法 收集本科室30 例有明确病理诊断的新鲜乳腺癌及相对应的癌旁正常组织,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-491-5p及叶酸受体 1(folate-receptor 1,FOLR1)基因表达量.选取MCF-7 细胞,分为:control组、NC-mimics组、miR-491-5p mimics组、NC inhibitor组和miR-491-5p inhibitor组,克隆形成实验检测细胞增殖能力,Transwell 实验检测细胞侵袭能力,Western blot 检测 AKT/mTOR信号通路 p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表达情况.双荧光素酶实验检测分析miR-491-5p与FOLR1 间的靶向关系.选取MCF-7 细胞进行回复实验,分为NC inhibitor组、miR-491-5p inhibitor组、miR-491-5p inhibitor+si-NC组和miR-491-5p inhibitor+si-FOLR1 组,克隆形成实验及Transwell实验分别检测细胞增殖及侵袭变化,Western blot检测AKT/mTOR信号通路p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表达情况.结果 与癌旁正常组织相比,癌组织中miR-491-5p的基因表达量明显降低(P＜0.05),FOLR1 基因表达量明显升高(P＜0.05).与control组及NC-mimics组相比,miR-491-5p mimics组细胞增殖及侵袭能力均降低(P＜0.05),p-AKT和p-mTOR蛋白表达量减少(P＜0.05);与control组及NC inhibitor组相比,miR-491-5p inhibitor组细胞增殖及侵袭能力均升高(P＜0.05),p-AKT和p-mTOR蛋白表达量增高(P＜0.05).双荧光素酶报告基因检测证明FOLR1 是miR-491-5p的靶标.回复实验表明,与miR-491-5p inhibitor组及miR-491-5p inhibitor+si-NC组相比,miR-491-5p inhibitor+si-FOLR1 组细胞增殖及侵袭能力明显降低(P＜0.05),p-AKT和p-mTOR蛋白表达量显著减少(P＜0.05).结论 miR-491-5p靶向FOLR1 抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭,可能与改变AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达具有一定相关性.
目的 探究胆汁酸(bile acids,BAs)和MAPK信号通路对HepG2 细胞中人类过氧化物酶体增殖物激活受体α(human peroxisome proliferation activated receptor α,hPPARα)转录表达的调控作用.方法 PCR扩增hPPARα基因启动子片段P1(-764～+228 bp)、P2(-2090～-744 bp)、P2-1(-744～-1287 bp)、P2-2(-1548～-1265 bp)、P2-3(-2090～-1540 bp),将扩增得到的片段分别插入荧光素酶报告基因质粒(pGL4-luc2P-Hygro)的启动子上游.将包含hPPARα基因启动子片段的荧光素酶报告基因质粒转染HepG2细胞,分别用U0126(ERK1/2信号通路选择性小分子抑制剂)、SP600125(JNK1/2信号通路选择性小分子抑制剂)、石胆酸(lithodeoxycholic acid,LCA)、脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)、鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)、甘氨脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid,GDCA)、熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)进行处理,每次处理均以DMSO处理组作为对照,通过双荧光素酶报告基因试验分别检测ERK1/2、JNK1/2信号通路以及胆汁酸对hPPARα启动子片段的调控作用.另外,在HepG2细胞中共转染荧光素酶报告基因质粒与人类法尼酯X受体(human farnesoid X receptor,hFXR)过表达质粒,用GW4064 激活过表达的hFXR,通过双荧光素酶报告基因试验检测胆汁酸的生理受体hFXR对hPPARα启动子片段的调控作用.利用数据库预测片段中相关转录因子的结合位点,通过重组PCR定点突变以及双荧光素酶报告基因试验验证所预测位点的作用.结果 与DMSO对照组相比,U0126 组P1、P2片段的转录活性无显著变化;SP600125 组P2片段的转录活性被显著抑制(P＜0.05).进一步研究表明,SP600125 对P2-1、P2-2、P2-3片段的转录活性均有抑制作用(P＜0.01).在P2-1 片段中预测得到两个c-Jun结合位点,其中位点 1 突变减弱了SP600125 的抑制作用(P＜0.000 1),而位点 2突变没有影响SP600125的抑制作用.在5种胆汁酸的处理中,与DMSO对照相比,LCA处理显著抑制P2片段的转录活性(P＜0.05),而CDCA、DCA、GDCA、UDCA处理没有影响P2片段的转录活性.在HepG2细胞中过表达hFXR,GW4064激活显著诱导P1、P2片段的转录活性(P＜0.01),将P2片段中预测得到的FXR反应元件(FXR response element,FXRE)进行重组PCR定点突变后,hFXR的诱导作用显著减弱(P＜0.05).结论 胆汁酸和MAPK信号通路在HepG2细胞中调控hPPARα的转录表达,其中JNK1/2信号通路通过hPPARα启动子中c-Jun结合位点调控其转录表达;hFXR通过hPPARα启动子中FXRE诱导其转录表达;LCA抑制hPPARα的转录表达.
目的 探讨孕早期超声提示胎儿颈项透明层(nuchal translucency,NT)增厚与染色体异常类型的相关性,为临床遗传咨询及优生优育提供依据.方法 选取2017 年 1 月至2022 年 12 月因胎儿NT增厚接受介入性产前诊断的 181 例单胎孕妇,所有病例均同时进行G显带染色体核型分析与染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis,CMA),综合分析不同NT值胎儿染色体异常率和异常类型情况.结果 181 例NT增厚胎儿中检出明确致病性染色体异常28 例(15.47%),染色体非整倍体23 例,其中21 三体染色体 15 例,18 三体4 例,Turner's综合征4 例,致病性拷贝数变异5 例;此外检出可能致病性拷贝数变异3 例及意义不明确异常4 例.181 例中高龄孕妇为 30 例(16.57%),致病性染色体异常率为 36.67%(11/30);非高龄组 151 例(83.43%),致病性染色体异常率为 11.26%(17/151).结论 NT增厚与染色体异常有一定的相关性,孕早期超声测量胎儿NT值厚度具有重要的临床意义.联合应用染色体核型分析与CMA可提高染色体异常的检出率,减少漏诊率,为胎儿产前诊断及遗传咨询提供准确的遗传学信息.
目的 了解太原市某三甲医院非呼吸道标本分离的高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)感染特点、耐药性、高毒力荚膜多糖血清分型及序列分型.方法 收集2021 年 10 月至2022 年 12 月山西白求恩医院非呼吸道标本分离肺炎克雷伯菌(KP)171株,以检测到毒力基因iucA及prmpA/prmpA2 为依据,将菌株分为阳性组(hvKP组)和阴性组(经典KP,cKP组).卡方检验分析感染部位、感染类型、耐药菌株以及6 种高毒力荚膜多糖血清型(K1、K2、K5、K20、K54 和K57)在两组中的分布特征,二分类logistic回归筛选hvKP感染高危因素,采用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)对hvKP进行分子分型.结果 hvKP在肝脓肿、脓毒血症、其他部位脓肿及腹部感染中存在优势分布(均P＜0.05),cKP在尿路感染中存在优势分布(P＜0.05);社区获得性感染是该医院非呼吸道标本分离hvKP的主要感染类型(P＜0.001);血清白蛋白(ALB)＜28.6 g/L是hvKP感染独立危险因素(OR=2.832,95%CI 1.207～6.646,P =0.017).非呼吸道感染 hvKP 对临床常用抗菌药物耐药率保持在3.08%～18.46%之间,除阿米卡星外,均显著低于cKP组(均P＜0.05).高毒力荚膜多糖血清型K1、K2 占hvKP总数的52.31%和21.54%,与hvKP高度相关(均P＜0.001);K5、K20、K54、K57 检出率较低(1.54%～4.62%),未发现与hvKP存在相关性(均P＞0.05).MLST将hvKP分成 18 种不同的序列类型(sequence type,ST),其中ST23 占50.77%,其次为ST65 和ST86,均占7.70%.ST23 型hvKP与K1 血清型密切相关(P＜0.001).非ST23 型hvKP则与K2 血清型密切相关(P＜0.001),主要对应ST65(35.71%)和ST86(28.57%)型.暂未发现ST23 型hvKP获得碳青霉烯耐药表型.结论 该医院非呼吸道标本分离的hvKP主要与多个部位脓肿(包括肝脓肿)、脓毒血症及腹部感染相关,但很少侵犯泌尿系统,并且以引起社区获得性感染为主.患者血清ALB水平低下,更容易发生hvKP的感染.目前该医院非呼吸道感染的hvKP耐药程度较低,K1、K2 高毒力荚膜多糖血清型高度流行,ST23 型是其主要序列分型.
目的 探讨miR-4465 调控第 10 号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)甲基化对喉癌Hep-2 细胞增殖、侵袭和迁移的影响.方法 选取 2017 年 1 月至 2022 年 1 月复旦大学附属中山医院青浦分院耳鼻喉科手术治疗患者的喉癌组织及相应的癌旁组织20 例,实时荧光定量RT-PCR检测组织中miR-4465 和PTEN的表达,甲基化特异性PCR检测PTEN甲基化水平,Pearson法分析癌组织中miR-4465 和PTEN的相关性,并分析PTEN基因启动子甲基化率与性别、年龄、临床分型、肿瘤分期、淋巴结转移的关系.将Hep-2 细胞分为空白组、对照组(转染mimic NC)、miR-4465 mimic组(转染miR-4465 mimic),qRT-PCR检测Hep-2 细胞中PTEN mRNA表达,Western blot检测Hep-2 细胞中PTEN蛋白表达,CCK-8 检测Hep-2 细胞增殖,Transwell实验检测Hep-2 细胞侵袭,细胞划痕愈合实验检测Hep-2 细胞迁移.再将Hep-2 细胞分为pcDNA3.0 组(转染pcDNA3.0 质粒)和pcDNA3.0-PTEN组(转染pcDNA3.0-PTEN质粒),CCK-8 检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭,细胞划痕愈合实验检测细胞迁移.结果 喉癌组织中miR-4465 和PTEN的相对表达低于癌旁组织(P＜0.001);癌组织中miR-4465 的表达与PTEN呈正相关性(r =0.459,P=0.036);PTEN在癌组织的甲基化率明显高于癌旁组织(P＜0.001);PTEN基因启动子甲基化率与性别、年龄、临床分型无相关性(P＞0.05),与肿瘤分期、淋巴结转移具有一定的关系(P＜0.001).与空白组和对照组相比,miR-4465 mimic组PTEN mRNA和蛋白相对表达显著升高(P＜0.001),miR-4465 mimic组Hep-2 细胞增殖能力明显降低(P＜0.001),Hep-2 细胞侵袭能力明显降低(P＜0.001),Hep-2 细胞迁移率明显降低(P＜0.001).与pcDNA3.0 组相比,pcDNA3.0-PTEN组Hep-2 细胞增殖、侵袭、迁移能力明显降低(P＜0.001).结论 miR-4465 在喉癌组织中低表达,过表达miR-4465 可以抑制Hep-2 细胞的增殖、侵袭和迁移,这可能与PTEN启动子甲基化程度降低和PTEN表达增加有关.
目的 基于数据挖掘分析中药治疗肌肉萎缩的用药规律,运用网络药理学探究核心药对治疗肌肉萎缩的作用机制.方法 收集整理中国知网和《中医方剂大辞典》治疗肌肉萎缩的相关方剂,利用中医传承辅助平台(V2.5)探讨用药规律,基于药物频数分析和关联分析获得核心药对.在中药系统药理学数据库与分析平台和Swiss Target Prediction数据库获得核心药对的化学成分及作用靶点,在OMIM、GeneCards和TTD数据库筛选疾病作用靶点,使用在线韦恩分析工具获得药物和疾病的交集靶点,在STRING数据库中进行交集靶点的蛋白质与蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析,在Metascape数据库里完成交集靶点的GO及KEGG分析,最后采用分子对接技术完成核心成分和关键靶点的对接验证.结果 数据挖掘共筛选出方剂 182 首,中药201 味,以补虚药为主,其中黄芪-熟地黄支持度最高,作为核心药对.核心药对与肌肉萎缩的交集靶点有 86 个,对应 16 个化学成分,其中槲皮素、山奈酚和豆甾醇最为重要.经过PPI网络分析得到的关键靶点有AKT1、TNF和IL-6 等.GO富集分析得到 1 616 条生物过程,90 条细胞组成,117 条分子功能.KEGG通路分析得到 176 条相关信号通路,包括癌症通路、PI3K-Akt信号通路和HIF-1 信号通路等.分子对接结果显示,核心成分与关键靶点对接良好,其中豆甾醇与AKT1 的结合性最好.结论 中药治疗肌肉萎缩以益胃养阴、补血滋阴、健脾益气为主.黄芪-熟地黄药对能通过多成分、多靶点、多通路来干预肌肉萎缩病程.
目的 探讨免疫球蛋白μ结合蛋白2(Ighmbp2)在小鼠肝细胞癌(HCC)中上调表达的可能机制.方法 20 只小鼠注射生理盐水,收集其肝组织作为SL组.80 只小鼠注射H22 肝癌细胞系,分别收集注射3d的小鼠的肝组织、30d未成瘤小鼠的肝组织及成瘤小鼠的癌旁组织和瘤组织,分别作为H3L组、H30NL组、H30L组和H30T组.采用全转录组测序和生物信息学分析Ighmbp2 基因在各组中的表达,并进一步采用华大基因多组学系统筛选差异表达的Ighmbp2 相关基因,构建差异表达相关基因的PPI、Target以及ceRNA网络,分析其功能.结果 与SL组相比,H3L组、H30NL组、H30L组和H30T组Ighmbp2基因表达均上调,其中H30T组中表达最高;组间比较显示,仅H30T组与其他四组间Ighmbp2 基因的表达差异具有统计学意义(P＜0.05).PPI、Target和ceRNA调控网络显示,与Ighmbp2 存在密切关系的转录本有5 个、基因编码蛋白有43 个,互为竞争性ceRNA的分子有 143 个,其中miR-107-5p、miR-3064-5p和miR-1968-5p在H30T组中的表达显著低于其他各组,转录本XM_006531702.1 大量表达于各组,并且在H30T组的表达远高于其他组.GO和KEGG富集分析发现,Ighmbp2 及其相关基因共同参与的功能包括核苷酸结合、ATP结合等,其中部分基因与Ighmbp2 基因一样属于核、核仁等细胞组分.结论 Ighmbp2基因的上调表达主要是转录本XM_006531702.1 的上调表达;miR-107-5p、miR-3064-5p和miR-1968-5p这3 种miRNA可能在瘤体组织中低表达从而减弱了抑制效应进而间接促进Ighmbp2 在瘤体组织中的上调表达,其中miR-1968-5p可能是影响Ighmbp2表达的关键因素,多种相关分子可能与以上3 种miRNA结合形成ceRNA调控机制进而进一步精细调控Ighmbp2 的表达.
目的 探讨滑膜成纤维细胞(synovial fibroblast,SF)来源的外泌体中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对骨关节炎(OA)软骨细胞增殖、凋亡以及炎症反应的影响.方法 对获得HMGB1 沉默稳转滑膜的成纤维细胞(滑膜成纤维细胞组)和ExoQuick-TC试剂盒处理后细胞(Exo组)提取上清液,用Western blotting检测两组HMGB1、CD63 及CD81 蛋白的表达.将软骨细胞HC-A分为空白对照组、IL-1 β组(100 pg/ml IL-1β预刺激)和IL-1 β+Exo组(100 pg/ml IL-1β预刺激+50μg/ml滑膜成纤维细胞来源的外泌体),并使用实时定量PCR方法检测IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-13 和COL2A1 的mRNA水平.随后将IL-1 β处理的软骨细胞分为IL-1 β组、IL-1 β+Exo组、IL-1 β+Exo+NC-siRNA组和IL-1 β+Exo+HMGB1-siRNA组.IL-1 β+Exo+NC-siRNA组和IL-1 β+Exo+HMGB1-siRNA组IL-1 β处理的软骨细胞分别加入转染NC-siRNA或HMGB1-siRNA的滑膜成维细胞来源外泌体.采用CCK-8 实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,以及实时定量PCR检测MMP-1、MMP-13、COL2A1 mRNA的表达.结果 与滑膜成纤维细胞组比较,Exo组外泌体标志物CD63、CD81 以及HMGB1 蛋白表达显著升高,即滑膜成纤维细胞来源的外泌体鉴定成功.与空白对照组比较,IL-1 β组软骨细胞增殖能力显著降低,细胞凋亡率显著升高,IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-13 mRNA表达水平均显著升高,COL2A1 mRNA表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与IL-1 β组比较,IL-1 β+Exo组软骨细胞增殖能力显著增加,细胞凋亡明显抑制,IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-13 mRNA的表达上调,COL2A1 mRNA的表达下调(均P＜0.05).与IL-1 β+Exo+NC-siRNA组比较,IL-1 β+Exo+HMGB1-siRNA组软骨细胞增殖能力显著降低,细胞凋亡率显著升高,IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-13 mRNA表达水平显著升高,COL2A1 mRNA表达水平均显著降低(均P＜0.05).结论 滑膜成纤维细胞来源的外泌体可通过HMGB1 抑制软骨细胞炎症反应、软骨降解以及细胞凋亡.
目的 建立同时检测甜梦口服液(甜梦合剂)中的淫羊藿苷、紫丁香苷和 23-乙酰泽泻醇B含量的RP-HPLC法.方法 利用Shimadzu CLC ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)分离甜梦口服液中3 种成分(淫羊藿苷、紫丁香苷和23-乙酰泽泻醇B).测定波长:淫羊藿苷为271 nm、紫丁香苷为265 nm和23-乙酰泽泻醇B为207 nm;柱温30℃,进样体积 10μl.流动相:0.3%磷酸溶液(流动相A)-乙腈(流动相B),洗脱程序:0～4 min(95%A)、4～7 min(95%～78%A)、7～10 min(78%～38%A)、10～16 min(38%～26%A)、16～23 min(26%～19%A)、23～28 min(19%A)、28～28.5 min(19%～95%A).外标法检测3 种成分的含量.结果 紫丁香苷、23-乙酰泽泻醇B和淫羊藿苷分别在0.196 2～19.62 μg/ml,0.754 4～75.44 μg/ml和0.196 6～19.66 μg/ml质量浓度范围内存在良好的线性关系,线性系数R2 均大于 0.995;平均加标回收率分别为 99.47%,98.68%和 100.26%;仪器精密度和方法重复性RSD(n =6)均在 5.0%以内.结论 建立的RP-HPLC法具有线性范围广、检测结果准确等优点,可以用于甜梦口服液(甜梦合剂)供试品的质量控制.
