为构建鹅鼠伤寒沙门菌单基因缺失株并鉴定其生物学特性,本研究以广东地区鹅源鼠伤寒沙门菌流行株A29为研究对象,采用 λ-Red同源重组技术,分别构建crp、hfq基因缺失株(A29Δcrp和A29Δhfq)及相应基因回补株,并分别采用相应引物经PCR鉴定.通过细菌培养,对各菌株生物学特性进行比较;通过PCR鉴定各菌株的遗传稳定性;采用K-B纸片扩散法检测各菌株的药物敏感性;将各菌株纯培养物经腹腔注射4周龄小鼠,测定各菌株对小鼠的毒力,并观察感染后小鼠的临床症状及各组织剖检病变与组织病理变化.PCR和测序结果表明,正确构建各基因缺失株和相应回补株.生物学特性试验结果显示,与亲本株相比,A29Δcrp菌落直径极显著变小(P＜0.001),不产酸、不产生H2S,菌体极显著变短(P＜0.001);A29Δhfq菌落边缘不整齐,不产生H2S,菌体极显著变长(P＜0.001),表明crp、hfq基因影响细菌的菌落形态、生化特性和形态特征.菌株遗传稳定试验结果显示,菌株传至60代时,基因缺失株仍能够稳定缺失.药敏试验结果显示,与亲本株比较,A29Δcrp对氨基糖苷类、碳青霉烯类、环丙沙星、甲氧苄啶、阿奇霉素等药物的敏感性降低,对四环素类药物的敏感性增强,A29Δhfq对除青霉素类、头孢唑啉以外的12种药物的敏感性增强.小鼠毒力试验结果显示,与亲本株的LD50(2.479×104 cfu)相比,A29Δcrp 的 LD50(5.379×105 cfu)和 A29Δhfq 的 LD50(5.012×106 cfu)均明显上升.各菌株感染小鼠后的临床症状及各组织剖检病变基本一致;组织病理变化观察显示,与亲本株相比,A29Δcrp组小鼠肝组织可见多量大小不一的坏死灶,脾组织红髓面积增大、白髓面积减小,A29Δhfq对小鼠脾脏、肝脏及脑组织损伤均较小.本研究为探究鼠伤寒沙门菌crp 和hfq基因功能奠定了基础,同时也为进一步研发鹅沙门菌病疫苗提供了参考依据.

为了解鸭疫里默氏杆菌在广东佛山地区养殖水禽群中的流行、耐药和对雏鸭的致病力等情况,本研究从该地区6个鹅场、9个鸭场共采集130份有疑似传染性浆膜炎临床症状的肝、脑样品,经分离、纯化和鉴定获得15株鸭疫里默氏杆菌.对新分离株的16S rRNA进行测序及遗传进化分析,并进一步检测新分离株的耐药性和对雏鸭的致病性.结果表明:所有分离株16S rRNA遗传进化上均与鸭疫里默氏杆菌血清Ⅰ型参考株TRa1处于同一进化分支;15株分离菌对阿莫西林、青霉素、链霉素等8种常用抗生素表现多重耐药,而对头孢唑啉、大观霉素和氟苯尼考敏感.选取一株鸭源菌株(Y15)进行雏鸭致病性试验,感染组雏鸭死亡率为60％,病死鸭表现典型鸭疫里默氏杆菌病临床症状.本研究结果为进一步了解鸭疫里默氏杆菌在广东地区水禽群中的流行、耐药性以及致病力情况提供参考依据.

本试验采用H7 N9亚型流感油乳灭活疫苗,对雏鸡、雏番鸭和雏鹅作3种不同程序的免疫试验[“2周龄,0.3 mL/只,肌肉注射”(程序1)、“2周龄,0.5 mL/只,肌肉注射”(程序2)、“2周龄,0.3 mL/只,3周龄0.6 mL/只,肌肉注射”(程序3)],以了解H7N9亚型禽流感油乳灭活疫苗对鸡、番鸭、鹅诱导免疫应答的基本能力和不同接种方法诱导鸡、番鸭、鹅产生HI抗体反应的情况.研究结果表明,本疫苗对3种雏禽都具有较好的免疫原性,以番鸭反应最强,鹅、鸡次之;不同免疫程序分析表明,雏鸡和雏鹅,以程序3优于程序2,程序2优于程序1;雏番鸭,以程序3和程序2优于程序1.3种动物(鸡、鸭、鹅)各周平均HI效价分别为4.46 Log2、6.31 Log2、5.60 Log2.研究结果为H7N9亚型禽流感油乳灭活疫苗的评价及相关禽类的免疫程序的制订提供了依据.

为了明确目前广东省水禽源沙门菌的优势血清型及其分子流行病学动态,采用细菌分离纯化、生化特性鉴定和PCR扩增从316份样品中分离鉴定出188株水禽源沙门菌;采用玻片凝集法将分离株分为4(B、D、C1、E1)个群别8种血清型;采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型法对分离株进行分子分型,得到PFGE-XbaⅠ带型62种,菌株间相似度为54.1％～100.0％,分为A～I共9个聚类簇与11个单一基因型.结果 表明,广东水禽源沙门菌优势血清型为鼠伤寒沙门菌,PFGE-XbaⅠ带型具多样化,其中11种PFGE-XbaⅠ带型在区域和年份小范围集中流行,32种带型跨区域与跨时间交叉分布呈散在“流行暴发”,不同血清型分离株的PFGE-XbaⅠ带型差异较大,相同血清型的分离株PF-GE-Xba Ⅰ带型一般具有相同图谱型或聚类在一起.本研究采用PFGE法进行分子分型分析具有流行病学意义,并探明了本地沙门菌分离株血清型与分子分型的关系.

本研究从广州番禺某鸡场送检病死鸡中分离获得1株疑似Ⅰ群禽腺病毒.病鸡剖检以心包积液、肝脏呈土黄色并伴有出血点,肾脏肿胀、出血为主要特征.实验室通过血凝试验、PCR鉴定、序列测定及遗传进化分析、动物回归试验、病理组织学观察等进行一系列检测.结果 显示,该毒株不能凝集鸡红细胞,根据FAdV的六邻体(Hexon)基因设计引物,进行PCR扩增和单克隆测序,PCR扩增出分子量约为550 bp的特异性条带,通过序列测定和遗传进化分析表明,该分离病毒株与FAdV-4的相似性最高.同时用该分离毒株的鸡胚尿囊液感染28日龄雏鸡,试验鸡可复制出与临床相似病例,病理组织学观察可见,心肌细胞有炎性细胞浸润,肝内有嗜碱性包涵体等病变特征.综上,分离株B13为Ⅰ群FAdV-4.

目的 通过分析佛山及其周边地区水禽沙门菌感染的血清型分布特征,为防控水禽沙门菌病与制定公共卫生安全措施提供参考信息.方法 本试验对发病水禽采用细菌分离纯化、生化特性鉴定、PCR方法鉴定获得30株水禽沙门菌,以玻片凝集反应法作血清型鉴定.结果 30株水禽沙门菌的血清型含4(B、D、C1、E1)个群别7种血清型,B群有25株沙门菌分离株,包括19株鼠伤寒沙门菌(S.Typhimurium)、3株乙型副伤寒沙门菌(S.Paratyhi)、2株印第安纳沙门菌(S.Indiana)、1株斯坦利沙门菌(S.Stanley);D群有肠炎沙门菌(S.Enteritidis)1株;C1群有2株波茨坦沙门菌(S.Potsdam);E1群有2株明斯特沙门菌(S.Muenster).结论 30株水禽沙门菌分离株均为人兽共患血清型,其中B群鼠伤寒沙门菌为优势血清型,对于水禽感染沙门菌病的防控,应优先考虑鼠伤寒沙门菌感染.

通过对广东佛山、中山等地出现以脱毛,皮肤潮红,生长缓慢为特征的樱桃谷商品肉鸭群的病鸭组织进行病原检测,初步诊断为鸭圆环病毒(DuCV)感染.采用常规PCR方法,扩增出4株DuCV的全基因序列,并进行序列比较及遗传进化分析.结果显示:4株DuCV全基因与德国株AY228555,广西株KC460527、KC460530、KC460532、KC460535属于同一进化分支,同源性为94.8％～99.3％,均属于DuCV-1型;而与DuCV-2型代表株台湾株AY394721的同源性为82.9％ ～ 83.4％.该研究为鸭圆环病毒感染的监控和诊断提供了依据.

Four new H9N2 avian influenza viruses (AIVs) were isolated from domestic birds in Guangdong between December 2015 and April 2016. Nucleotide sequence comparisons indicated that most of the internal genes of these four strains were highly similar to those of human H7N9 viruses. Amino acid substitutions and deletions found in the HA and NA proteins indicated that all four of these new isolates may have an enhanced ability to infect humans and other mammals. A cross-hemagglutinin-inhibition assay, conducted with two vaccine strains that are broadly used in China, suggested that antisera against vaccine candidates could not provide complete inhibition of the new isolates.

为研究鼠伤寒沙门菌感染鹅的病理组织学变化,采取肌肉注射鼠伤寒沙门菌的方法,人工感染58日龄健康鹅,对试验鹅进行病理剖检,并采取心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑、胰腺和肠道病料制作病理切片,观察病理组织学变化.结果可见,受感染鹅18 h内开始出现死亡,死亡率达66.7％;主要病理变化为皮下、心肌、肝脏、脾脏、肠道、脑膜等多组织器官多处充血、出血,肝脏实质肿胀,表面可见大量大小不一的雪花状坏死灶,胆囊、脾脏肿大;病理组织学变化为心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肠道等多组织器官的细胞变性、坏死,大量红细胞及炎性细胞浸润.研究结果表明,鼠伤寒沙门菌感染鹅,致病性强、死亡率高,感染鹅可出现全身多组织器官充血、出血与组织细胞变性、坏死的急性败血症.

为了了解水禽沙门氏菌对目前常用抗菌药物的耐药情况,试验对采集自广东部分地区27个水禽场疑似患病水禽的病变样品进行沙门氏菌的分离鉴定,并对分离菌株采用琼脂二倍稀释法进行20种常用抗菌药物的敏感性试验.结果表明:共分离到33株水禽沙门氏菌,它们对氨苄西林(AMP)、阿莫西林(AML)和恩诺沙星(ENR)的耐药率高达100％;对氯霉素(CHL)、氟苯尼考(FFC)、萘啶酸(NAL)和强力霉素(DOX)的耐药率均超过80.0％;对喹(口恶)啉类药物最为敏感,耐药率仅为12.1％.33株沙门氏菌有19种耐药谱,并且出现严重的多重耐药性,多重耐药率高达97.0％;其中6重耐药菌株占比为36.4％,在多重耐药率中所占比例最高.说明水禽沙门氏菌耐药现象非常严重和复杂,对抗菌药物的耐药谱越来越广,可选药物越来越少,联合用药效果越来越差.

自1997年-2016年从广东佛山、肇庆、云浮等地疑似新城疫的家禽病料分离鉴定获得12株新城疫病毒,采用RT-PCR方法对所有分离株的F基因和HN基因进行扩增,产物经克隆并测序后与Gen-Bank数据库中的参考毒株做遗传进化分析.12个分离株的F基因遗传进化分析结果显示,9株属于基因Ⅶ型,2株属于基因Ⅸ型,1株属于基因Ⅵ型.F基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在81.6％～91.5％之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84.8％～99％之间;HN基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在80.9％～91.9％之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84％～98.5％之间.氨基酸序列分析表明,12个分离株与NDV强毒株的氨基酸特征相符,有10个分离株的HN基因第514氨基酸残基出现Ⅰ→Ⅴ的变异,有9个分离株的F基因和HN基因的中和抗原位点出现变异.试验提示,当前广东部分地区的分离株与传统疫苗株之间存在抗原性差异,故应加强广东地区新城疫病毒的分子遗传监控.