[目的]构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组猪痘病毒(recombinant Swinepox viruis,rSWPV),制备抗GFP单克隆抗体.[方法]首先合成3'-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV(SWPV-JX20G株)同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His.重组病毒进行PCR和SDS-PAGE鉴定,扩增并纯化EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗GFP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗GFP单克隆抗体进行效价及特异性鉴定.[结果]PCR和SDS-PAGE结果显示,成功构建并纯化到rSWPV-EGFP-His,该病毒感染PK15细胞可稳定表达EGFP-His蛋白,蛋白大小约27 ku,为可溶性表达,镍柱纯化的EGFP-His蛋白溶液呈明显的绿色.EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠血清抗体效价高达1 ∶ 256 000.采用杂交瘤技术制备了 9株能稳定分泌抗EGFP-His单克隆抗体的杂交瘤细胞株,间接ELISA和Western blotting结果显示,9株单克隆抗体中的7株针对GFP的线性表位,另外2株单克隆抗体针对GFP的构象表位.[结论]本研究成功制备了 EGFP-His蛋白和9株抗EGFP-His的单克隆抗体,为后续建立GFP的免疫学检测方法提供了必备材料.

为建立用于检测临床粪便样品中胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,L.intracellularis)的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究参考GenBank中发表的L.intracellularis PHE/MN1-00株基因组序列设计50对引物,通过SYBR Green Ⅰ荧光染料法PCR验证引物的特异性,针对扩增效率最好的特异性上、下游引物合成相应的TaqMan探针,优化反应条件,对其线性范围、敏感性和重复性进行验证,系统的完成了该方法的建立.结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR方法,特异性强;在靶标核酸为2.95×101～2.95×106拷贝/μL区间线性关系良好,相关系数R2=0.998 1,扩增效率为96.51％;最低检测浓度为5拷贝/μL;批间和批内的CV均小于2％,重复性好.使用普通PCR方法与本方法对2020年10月至2021年2月采自江西地区猪场的373份粪便样品进行检测,L.intracellularis的总检出率分别为21.4％(80/373)和27.6％(103/373),显示本方法具有更高的敏感性,其检测场阳性率为88.9％(8/9),各阶段生产猪群阳性率分别为经产母猪28.7％、保育仔猪36.4％和育肥猪14.3％.该检测结果为江西地区的L.intracellularis的流行情况提供参考.

针对江西某猪场肥猪出现血便症状,取病变肠组织提取DNA,采用猪胞内劳森菌荧光定量PCR试剂盒检测,并对PCR扩增产物进行序列测定和分析,结果表明,其与胞内劳森菌参考序列(AM180252.1和CP004029.1)同源性为100％.同时采集7个猪场的正常猪群粪便通过猪胞内劳森菌的荧光定量PCR检测方法进行检测,结果显示,猪增生性肠炎在各猪场的感染率为16.7％～40％,平均感染率为30.06％.

为探究猪痘病毒作为载体表达猪圆环病毒2型(PCV2)-Cap蛋白,插入外源基因P28-ORF2的拷贝数与PCV2-Cap蛋白表达量的关系.本试验以猪痘病毒为载体,通过双酶切连接及无缝克隆方法构建重组质粒,并纯化到了8株含不同拷贝数(1～8拷贝)P28-ORF2的重组猪痘病毒,基于荧光斑大小、电镜观察病毒粒子及Western blotting结果进行判断.纯化到的8株重组病毒的荧光斑直径为317.41～384.96μm,大小无明显差异.重组猪痘病毒粒子形态与亲本病毒一致.Western blotting结果为插入1拷贝P28-ORF2的重组蛋白表达量最低;随着P28-ORF2拷贝数的增加,PCV2-Cap表达量也随之增加;至插入4拷贝P28-ORF2时,PCV2-Cap表达量达到峰值;随后减少.8株重组猪痘病毒荧光斑大小无明显差异,表明猪痘病毒基因组中插入不同拷贝数P28-ORF2对重组病毒在PK15细胞内的增殖无影响.重组猪痘病毒粒子的形态未发生变化说明多拷贝外源基因的插入并未对猪痘病毒的结构造成影响.本研究结果表明,猪痘病毒为载体表达外源蛋白时,单启动子启动多拷贝外源序列能明显提高外源蛋白的表达量,插入4拷贝的外源序列为较合适的拷贝数.

对某猪场送检的一份出现神经症状的保育仔猪病料进行了细菌分离,并对该分离菌株进行了染色镜检、生化鉴定、PCR检测和药敏试验.革兰氏染色结果表明从病料中分离到1株革兰氏阳性链状球菌,其生化鉴定结果与猪链球菌生化特性一致.分离菌株16srRNA基因测序结果表明其与2型猪链球菌亲缘关系最近,同源性达100％,确定该分离菌株为2型猪链球菌.药敏试验结果表明该分离菌株对青霉素、恩诺沙星、氨苄西林、氟苯尼考、头孢噻肟、阿莫西林、氧氟沙星、诺氟沙星等高度敏感;对复方新诺明、多西环素、土霉素、头孢曲松、丁安卡那等中度敏感,对磺胺异恶唑耐药.

2017年4-7月份,江西某规模化猪场的育肥猪发生呼吸道疾病,为了找出病原,遏制病情扩散,试验对患病猪内脏进行细菌分离鉴定及体外抑菌试验,用微量生化法结合PCR法鉴定病原菌的种属,用琼脂扩散法进行药敏试验和抑菌试验,用腹腔注射法对小鼠进行攻毒试验.结果 表明:共分离得到6株分离菌,其中分离菌株JA1、JA2、JA4、JA5均不发酵糖类,M.R.、V-P、H2S等试验均为阴性,尿素、硝酸盐还原等试验均为阳性;分离菌株AP1、AP2发酵果糖、葡萄糖等,不发酵乳糖、鼠李糖等;分离菌株JA1、JA2、JA4、JA5与波氏杆菌同源性最高,分别为99.2％、99.4％、99.6％、99.5％;分离菌株AP1、AP2与胸膜肺炎放线杆菌同源性最高,分别为97.3％、98.4％.分离菌株JA1、JA2、JA4、JA5对青霉素G、氨苄西林、林可霉素等表现为耐药或中介,分离菌株AP1、AP2对恩诺沙星等表现为中介,对氟苯尼考等表现为敏感.乳酸菌(J2-100-R2、ZCR1-2)对分离菌有明显的抑菌作用,抑菌圈直径为17～26mm;注射分离菌的小白鼠36 h死亡率为66.67％,耐过小白鼠皮肤出现溃疡.说明该病是由支气管败血波氏杆菌与胸膜肺炎放线杆菌混合感染所致的呼吸道疾病;氟苯尼考与乳酸菌联合用药可以防治由支气管败血波氏杆菌与胸膜肺炎放线杆菌引起的呼吸道疾病.

为了寻找具有优势性能的乳酸菌,减少或替代抗生素在肉鸽养殖中的使用,试验采集2只健康肉鸽肠道内容物,用微量生化法结合分子生物学法进行细菌分离鉴定,用比对法进行生长特性试验,用琼脂扩散法进行体外抑菌试验,分离的乳酸菌腹腔接种小鼠进行菌株安全性试验.结果表明从2只健康肉鸽肠道内容物中分离得到4株生长迅速、产酸能力强的分离菌(分别标记为G2、G3、G4和G5),其生化特性与乳酸菌基本一致;分离菌16S rRNA核苷酸序列与唾液乳杆菌相似性最高,均大于99％;分离菌对氨苄西林等耐药,对罗红霉素高度敏感,对巴氏杆菌等指示菌均有较强的抑制作用;pH值越小分离菌G2发酵液抑菌活性越强,高温会略微降低抑菌活性但变化较小,酶可增加抑菌活性;腹腔接种分离菌发酵液的小鼠生长良好,未见异常.说明分离菌均为唾液乳杆菌,产酸能力强,耐胃蛋白酶和胆盐,对部分病原菌有较强抑制作用,安全无毒,具备成为益生菌的优势.

为了找到益生优势菌,扩大微生态制剂菌群资源,试验以获得的猪源益生肠球菌为研究对象,采用微量发酵管进行生化鉴定,PCR扩增法进行分子生物学检测,琼脂扩散法进行药敏试验和体外抑制试验,饮水法进行动物保护试验,对猪源益生肠球菌进行了筛选.结果 表明:分离出的6株菌ZDC1-80、Z2-80-R2、Z3-90-R1、Z2-90-R2、Z3-100-R1、Z3-100-R2均为有明显溶钙圈的革兰氏阳性球杆菌,除了棉籽糖,分离菌对大多数糖类都能发酵分解,1％马尿酸钠试验为阴性;分离菌在1 437 bp处出现目的条带,与肠球菌同源性最高,其中ZDC1-80、Z2-80-R2与希拉肠球菌同源性最高,Z3-90-R1、Z2-90-R2、Z3-100-R1、Z3-100-R2与粪肠球菌同源性最高;分离菌对阿莫西林等抗生素高度敏感,对诺氟沙星中等敏感,对链霉素等抗生素耐药;分离菌代谢物对病原指示菌均有抑制作用,对肠道病原菌抑制作用尤为显著;经过3周的观察,试验小鼠的生长状况良好.说明分离获得的猪源益生肠球菌具有广谱抗菌作用,其中Z3-100-R2的抑菌效果最强,可作为益生菌候选优势菌,与链霉素、克林霉素等配合用药,以减少抗生素的使用.

为调查福建规模化养鸡场病鸡的死亡原因,试验以福建省送检的鸡冠及头部皮肤有大量结节状痘痂的病鸡病料为研究对象进行了PCR鉴定.初步鉴定为鸡痘病毒(FWPV)株后,通过接种鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)分离病毒;用原代鸡胚成纤维细胞(CEF)和传代细胞DF-1细胞对病毒进行传代,观察该分离毒株在两种细胞上培养特性的异同;对被感染的CEF进行超薄切片观察病毒的分布及病毒粒子的形态;并针对该分离株的TK基因和FPV175基因序列进行同源性分析.结果 显示,接种经抗生素处理后的病料匀浆液上清的CAM出现大面积单个白色隆起的痘斑,匀浆痘斑后同时接种CEF和DF-1细胞,两种细胞均能产生稳定可持续传代的细胞病变,但病变出现的时间及病变程度不同;透射电镜下观察到典型的FWPV粒子密集分布在CEF的胞浆中,清晰可见卵圆形外膜包裹着的两侧凹陷的核心.对其中23个病毒粒子进行统计测得病毒粒子的大小为(258～344) nm×(153～238) nm;针对FWPV TK基因和FPV175基因的PCR检测及测序结果与GenBank收录的FWPV(登录号:NC_002188.1)核苷酸序列同源性分别高达100％和99.8％.以上结果表明该分离毒株为FWPV,命名为FWPV-FJ01,为国内FWPV的防治提供了参考依据.

为了确诊某猪场患病猪的病原菌,找到防控办法,对死亡猪肺脏、气管液进行细菌分离鉴定,经过生化试验、药敏试验、体外抑菌试验、动物试验等,得知:分离菌培养特性、生化反应特性与巴氏杆菌基本一致;分离菌高敏药物为头孢氨苄、头孢曲松等,低敏药物为青霉素G、林可霉素等;乳酸菌对巴氏杆菌有明显的抑菌作用;攻毒小白鼠48 h内全部死亡.结论:分离菌为多杀性巴氏杆菌,该病为多杀性巴氏杆菌引起的猪巴氏杆菌病,乳酸菌配合高敏药物能防治该病.

为了获得无耐药性、无毒副作用的生物药物减少抗生素的使用,将健康肉鸡肠道进行细菌分离鉴定及体外抑菌试验,结果得知:分离菌在MRS培养基上产生明显的溶钙圈,革兰氏染色阳性,呈圆形或卵圆形;发酵分解乳糖、甘露醇等糖类,H2S、V-P等试验为阴性,MR为阳性;在约1 400bp处出现目的条带,测序比对结果,分离菌与乳酸乳球菌同源性最高;该菌对阿奇霉素、红霉素等高敏,对头孢曲松、环丙沙星中敏,对诺氟沙星、四环素耐药;分离菌对病原指示菌均有抑制作用,其中对葡萄球菌、嗜水气单胞菌尤为显著;试验小白鼠均健康生长,无不良反应.结论:分离菌为乳酸乳球菌,具有广谱抑菌作用,可作为益生菌取代或减少抗生素的使用.

为鉴定外伤感染死亡兔的病原菌,采集病死兔肝、肺、肾等器官进行细菌分离鉴定及体外抑菌试验.结果表明:分离菌靛基质、枸橼酸盐等试验为阴性,凝固酶和过氧化氢酶试验为阳性,分解葡萄糖、麦芽糖等,不能分解淀粉;病菌对青霉素、卡那霉素等高度敏感,对氨卡西林,阿莫西林等耐药;枯草芽孢杆菌和鸡唾液乳酸杆菌对其均有较强的抑制作用.因此,分离菌为兔金黄色葡萄球菌,该病是由金黄色葡萄球菌引起的兔葡萄球菌病,防治首选药物为青霉素,枯草芽孢杆菌和鸡唾液乳酸杆菌可减少或部分取代抗生素对该病的防治.

为了诊断一起鸡细菌性感染死亡病例,对死亡鸡内脏进行细菌分离鉴定及体外抑菌试验.结果 得知:分离菌为G-短杆菌;能够分解葡萄糖、蔗糖等;对庆大霉素、环丙沙星等高度敏感,对青霉素、阿莫西林等耐药;鸡乳酸菌对其有较强的抑制作用;攻毒小白鼠病变明显.结论:分离菌为鸡大肠杆菌,该病是由大肠杆菌引起的鸡大肠杆菌病,治疗首选药物为庆大霉素,鸡乳酸菌配合高敏药物能够防治该病.

本试验采用分离培养法观察菌落形态特征,微量生化法检测生化特性,PCR扩增法进行分子鉴定,纸片扩散法检测耐药性,牛津杯法检测体外抑菌作用,人工感染动物法检测致病性,以期找到防控甲鱼大量发病的有效办法,对具有典型病状的甲鱼进行细菌分离鉴定.试验结果表明:得到4株形态一致的G-短杆菌JAY-1、JAY-2、JAY-3、JAY-4;均分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等,不分解乳糖、鼠李糖、木糖等,硝酸盐、枸橼酸盐等为阳性,H2S、尿素等为阴性;均在约1500 bp处出现目的条带,与气单胞菌同源性最高,与嗜水气单胞菌同一分支;对青霉素G、阿莫西林、林可霉素、头孢氨卞等完全耐药,对红霉素、四环素等耐药,对头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星敏感;8株乳酸杆菌对分离菌均有明显的抑菌圈;攻毒小白鼠24 h内均死亡,均分离到与自然发病株一致的菌株.说明分离菌均为嗜水气单胞菌,乳酸杆菌对分离菌具有显著的抑致作用,头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星等与乳酸杆菌配合用药,可作为临床防控嗜水气单胞菌的参考依据.

南昌某猪场仔猪大量死亡,为了查明病因,找到防控的有效办法,对死亡仔猪病变部位进行细菌分离培养,得到分离菌Z-d-1、Q-d-1、Q-d-2,用常规法对3株分离菌进行生化鉴定、药敏试验、致病性试验、体外抑菌试验.结果:Z-d-1与大肠杆菌的生化特性一致;Q-d-1、Q-d-2与气单胞杆菌生化特性一致;3株分离菌对大部分抗生素耐药,对丁胺卡那、呋喃唑酮均高敏;攻毒小白鼠24h均死亡;乳酸菌对其均有较好的抑制作用.结论:分离菌Z-d-1为大肠杆菌,Q-d-1、Q-d-2为嗜水气单胞杆菌;该病为大肠杆菌与嗜水气单胞杆菌混合感染所致;乳酸菌可取代或部分取代抗生素对该病的防治.

华南虎是中国的十大濒危动物之一、国家一级保护动物,红色物种名录极度濒危,在野外已灭绝.目前南昌市动物园饲养着20多只华南虎, 为了解圈养华南虎肠道细菌与腹泻的相关性,本研究拟对南昌市动物园圈养的华南虎新鲜粪便进行细菌总DNA提取,然后进行微生物多样性分析,以了解正常与腹泻时粪便中细菌群落的变化规律,为防治华南虎腹泻提供一定的科学依据.

In order to diagnose diseased rabbits,dead rabbits were dissected,and 4 strains,DX01,DX02,JX01 and JX02 were obtained from bacterial isolation and culture.According to conventional biochemical method,physiological-biochemical test showed that DX01 and DX02 could produce acids and gases in the presence of mannitol,lactose,glucose and maltose,and did not ferment sucrose,reactions of sodium citrate,urea,V-P,hydrogen sulfide and gelatin were negative,while reactions of indole,M-R and nitrate were positive,which were in accordance with the characteristics of colibacillus;and JX01 and JX02 both fermented mannitol,sucrose,glucose,maltose,and did not ferment lactose,reactions of indole,M-R,V-P,hydrogen sulfide and gelatin were negative,while the reaction of nitrate was positive,which were in accordance with the characteristics of Pasteurella.16S rDNA detection and sequencing showed that JX01 and JX02 shared 100％ homology with Pasteurella.The animal inoculation test of isolated bacteria showed that the mice in the experiment groups all died within 2 d.Original cultures were isolated from dead mice.DX01 and DX02 were identified as colibacillus,JX01 and JX02 were identified as Pasteurella,and the death of diseased rabbits was caused by mixed infection of pasteurellosis and colibacillosis.Drug sensitive test showed that DX01 and DX02 were only sensitive to kanamycin,ofloxacin and sulfamethoxydiazine,and not sensitive to other drugs,and JX01 and JX02 were sensitive to ofloxacin,sulfamethoxydiazine,gentamicin,furazolidone,doxycycline,streptomycin,trimoxazole and spectinomycin,and were moderately sensitive to cefradine.Ofloxacin and sulfamethoxydiazine are preferable for the clinical treatment of this disease.

In order to get biological drugs with no resistance or toxic side effects and to reduce the use of antibiotics, a strain of Bacillus subtilis was isolated from animal intestine, and the isolate was identified by molecular biological method; in vitro antibacterial test of the isolate was performed using agar diffusion method; the optimal fermentation condition of the isolate was screened by conventional culture method;the antibacterial crude protein of the isolate was extracted by saturated ammonium sulfate method; the physicochemical properties of antibacterial crude protein was detected by comparison method; The results showed that the isolate was B. subtilis ,which had antibacterial effects on Staphylococcus aureus, streptococcus and swine erysipelas. The fermentation effect of the isolate was the best under the condition of temperature 30 ℃, pH 7, liquid volume 75 ml/250 ml, inoculation volume 20％ and culture time 48 h. The antibacterial effect of the isolate was the best when extracted by 80％ saturated ammonium sulfate. The antibacterial crude protein had strong resistance to heat and acid. Organic solvent and UV irradiation had some influences on antibacterial crude protein. Proteases had hydrolytic effects on antibacterial crude protein. The isolated B. subtilis can be used to prevent and control the diseases caused by S. aureus, streptococcus and swine erysipelas, and can regulate intestinal microecology by adding into expanded feeds.