为探究NF-κB信号通路对鸭肠炎病毒(DEV)增殖的影响,本实验分别以不同终浓度的NF-κB信号通路激活剂LPS(2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL)和抑制剂SN50(25.0μg/mL、50.0μg/mL、75.0μg/mL)处理鸭胚成纤维(DEF)细胞后,采用CCK8法分析LPS或SN50对DEF细胞活性影响;利用不同浓度的LPS或SN50预处理DEF细胞4 h后,再于12 h～120 h后收获细胞和上清液(未感染DEV);上述经LPS或SN50预处理细胞4 h后接种DEV(MOI 0.01),12 h～120 h后(每间隔12 h)分别收获细胞及上清液,采用荧光定量PCR方法分别检测上述未感染和感染DEV的DEF细胞中NF-κB1基因和DEV NP基因的转录水平;采用ELISA方法分别检测上述未感染和感染DEV的DEF细胞上清液中NF-κB信号通路关键因子(IL-1β、IL-6和MyD88)的表达水平.结果显示:不同浓度的LPS和SN50处理对DEF细胞均无明显毒性作用.荧光定量PCR结果显示,经不同浓度LPS预处理,均能有效提高DEF细胞中NF-κB1基因的转录水平,其中4.0μg/mL LPS处理的DEF细胞中NF-κB1基因转录水平最高;而在LPS预处理再感染DEV后,4.0μg/mL LPS和6.0μg/mL LPS处理的DEF细胞中NF-κB1基因转录水平整体上调(p<0.05),2.0μg/mL LPS处理的DEF细胞中NF-κB1基因的转录水平整体下调(p<0.05);不同浓度的SN50预处理后,未感染和感染DEV的DEF细胞中,均以50.0μg/mL SN50处理的细胞中NF-κB1基因的转录水平下调效果最好(p<0.05).LPS预处理DEF细胞后感染DEV,12h～84 h DEV NP基因的转录水平均受到明显抑制(p<0.01),84 h后2.0μg/mL和6.0μg/mL LPS均会促进DEV NP基因的转录水平;而经SN50预处理DEF细胞后感染DEV,细胞中DEV NP基因的转录水平均显著下降(p<0.01).ELISA结果显示,经LPS预处理后,不感染或感染DEV,DEF细胞中IL-6表达量整体稍呈下降趋势(p>0.05),而IL-1β和MyD88的表达则呈无规律变化;经SN50预处理后不感染或感染DEV,DEF细胞中IL-1β、IL-6和MyD88的表达均无规律变化.以上研究结果表明,不同浓度LPS均可促进正常DEF细胞中NF-κB1基因的转录,而DEV则可以阻断低浓度LPS(2.0μg/mL)的这种促进作用.不感染或感染DEV,SN50均于高浓度(50μg/mL和75μg/mL)时才能有效降低NF-κB1基因的转录水平;不同浓度的LPS或SN50均对NF-κB通路关键因子的表达基本无影响;LPS在DEV感染后期才能促进其增殖,而SN50则可以有效抑制DEV的增殖.本研究为阐明NF-κB信号通路与DEV之间的相互作用关系奠定了实验基础..

为表达牛乳头瘤病毒1型贵州株(BPV1-GZLZ株)衣壳蛋白L1基因,采用PCR方法从贵州省六枝特区某规模化养牛场疑似病牛的皮肤肿瘤病料样品中扩增BPV1 L1基因,克隆至pMD19-T载体,测序后进行生物信息学分析;同时将BPV1-GZLZ株L1基因克隆于原核表达质粒pColdⅠ中,经IPTG诱导L1蛋白表达,并对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting分析.生物信息学分析显示,BPV1-GZLZ株L1基因核苷酸序列长为1488 bp,编码495个氨基酸,分子结构式为C2484H3884N678O737S16,理论等电点(PI)为8.68,二级结构主要包括α-螺旋、无规则卷曲和β-折叠为主,无跨膜结构域和信号肽;BPV1-GZLZ L1基因序列与BPV1参考株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.8％,处在同一遗传进化分支,且与BPV13和BPV2、BPV2-GZ01的亲缘关系较近;Western blotting结果显示,经IPTG诱导的重组表达蛋白能与His单抗产生特异性反应,条带为55.6 kD左右与SDS-PAGE结果一致.研究表明,试验构建了BPV1-GZLZ株L1基因原核表达载体并成功表达.

为了解贵州省某野生动物园内野生动物肠道寄生虫的感染情况,笔者采用饱和盐水漂浮法和沉淀法对该野生动物园的25种野生动物粪便进行了寄生虫卵的形态观察,并区分种类,统计了其感染率.结果显示,共检出4类寄生虫卵,分别为:线虫卵、球虫卵、绦虫卵和吸虫卵,总感染率为52％(13/25),以线虫、球虫感染较为突出.此次调查,为该野生动物园制定驱虫方案提供了科学依据,为贵州省野生动物寄生虫感染情况提供了基础数据.

旨在调查分析贵州省2013-2016年猪腹泻发病的情况.对贵州省5个地州(市)14县(区)24个种猪场和规模养猪场共9 133头猪进行猪腹泻发病情况、临床症状调查,并对病变组织进行病理组织学检查.调查结果显示:贵州省2013-2016年猪腹泻发生率为55.41％(5 061/9133),病死率为68.07％(3 445/5 061),其中安顺市的猪腹泻发病率和死亡率都较高;猪腹泻发病时间在冬春季节较为集中,主要危害产房仔猪;对具有明显腹泻症状的发病猪进行剖检,观察到病变有腹股沟淋巴结充血、胃壁和肠壁变薄、肠壁充气、黄色水样肠道内容物等;对病变组织切片,HE染色镜检,观察到小肠绒毛上皮脱落、变短.结果表明,贵州省近4年猪腹泻发病率和病死率高,产房仔猪危害较大.

为建立一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗免疫后在猪体内病毒血症持续时间的方法.根据GenBank中PRRSV基因序列,设计1对针对N基因扩增的特异性引物,经RT-PCR扩增后连接到pMD19-T载体上,构建含有N基因片段的重组质粒.采用SYBR Green I染料法进行荧光定量RT-PCR扩增,建立标准曲线并进行特异性、敏感性及重复性试验,比较分析该方法与商品化试剂盒检测结果的阳性符合率.结果显示,所构建方法的扩增效率为1.063,标准品各稀释度质粒拷贝数与Ct值之间相关系数为0.999,引物特异性强,可检测的最低核酸模板浓度为1.0×102 copies/μL,比常规PCR敏感性高10倍,重复性试验的变异系数均小于1％,与商品化试剂盒检测的阳性符合率达100％.两种方法检测结果均表明,在猪体内PRRSV疫苗病毒血症可持续3周.本研究建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,可为PRRSV感染(包括疫苗毒)的调查、监测和防控提供可行性和操作性强的技术支持.

为探明贵州省近几年引起猪病毒性腹泻两个主要病原PEDV与PoRV的变异情况,本研究对贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、黔东南洲等5个地(州市)26个规模化养猪场采集了213份疑似腹泻的粪便样品,采用实验室建立的PEDV、TGEV和PoRV三重RT-PCR检出PEDV阳性的病料12份和PoRV阳性病料4份.根据GenBank登录的PEDV和PoRV基因序列,分别设计PEDV M基因和PoRV VP7基因特异性引物,扩增目的基因、克隆、测序和遗传进化分析.结果显示:成功克隆了12株PEDV M基因(681 bp)和4株PoRV的VP7基因(981 bp),M基因核苷酸及推导的氨基酸同源性分别在98.1％～100％和98.2％～100％之间,与国内外参考毒株核苷酸及氨基酸同源性分别在97.4％～100％和97.3％～100％之间;VP7基因核苷酸及推导的氨基酸同源性分别为95.5％～99.7％和96.9％～99.7％,与国内外参考毒株核苷酸及氨基酸同源性分别为71.9％～95.1％和72.7％～99.1％.贵州省PEDV地方流行株与疫苗株CV777、Attenuated DR13亲缘关系较远,PoRV地方流行株与G4型毒株Gottfried、HeN4等属于同一群.结果表明,本研究从分子流行病学角度证实了贵州省PEDV和PoRV流行与变异情况,为贵州省PEDV和PoRV合理的防控措施提供参考依据.