958 lung tissue samples of swine influenza were collected in Guangxi from 2013 to 2014 to further study the pathogenic mechanism and prevention and control technology of influenza virus, and influenza virus isolation and biological characteristics analysis of Eurasian avian influenza (ER-H1N1) were performed. The positive rate of the 14 strains of ER-H1N1 swine influenza virus isolated was 1.46%, with 8 gene pieces all from avian sublineages, followed by recombinant Pdm/09 H1N1 fragments. Although their HA cleavage site is PSIQSR↓GLF or GIF, which has typical low-pathogenicity characteristics, the isolated virus strain grows well on the cell, and after the BALB/c mouse challenge experiment, the evidence of the isolated strain multiplying in the respiratory tract of mice is obvious, and the mice lose weight quickly, all die within a week and are accompanied by severe systemic infection. Based on changes in the amino acid residues of the A/swine/Guangxi/6/2013 (No.6) strain, it is thought that the NA protein E119G mutation is the main site where highly dangerous changes happen. D N mutations in the PB2 strains G2, g14, g21, g30, S2, 32, 7, and 8 show that these strains are gradually adapting to human sources. According to the traits of strains 30, G2, G14, and G21, NP develops 375 , which boosts pathogenicity. In summary, the ER-H1N1 subtype influenza virus is widespread in the Guangxi swine herd, and it is pathogenic to mice, with the trend of genomes derived from Pdm/09 H1N1 fragments increasing.

目的 利用定点突变技术突变Pdm/09 H1N1流感病毒的NA基因119位点并拯救,研究其生物特性.方法 利用重叠PCR的方法进行定点突变,再应用反向遗传学体系中的pBD-NA质粒后在293T细胞中转染拯救流感病毒,通过血凝试验和RT-PCR方法鉴定病毒拯救结果,通过细胞学和攻毒试验研究该位点变异的生物学意义.结果 定点突变测序结果显示,突变的pBD-NA质粒核苷酸第336位由A突变为G,使氨基酸位点发生E(核苷酸:GAA)到G(核苷酸:GGA)的变化,而其他位置的氨基酸均未发生改变.拯救的病毒转染后的细胞悬液接种MDCK细胞连续传代3代后突变毒株(rMT)血凝效价为27,亲本毒株(rWT)为26.神经氨酸酶的二级结构预测结果显示,rMT与rWT相比,Alpha Helix分值明显下降,均值同比下降约为10.62％,经突变后的rMT Alpha Helix结构分值表现为下降趋势.用rWT和rMT病毒攻毒BABL/c小鼠后第3天的小鼠肺组织、鼻甲骨、脾和肾的病毒滴度,rMT攻毒组均比rWT攻毒组高,鼻甲组织与肺脏中的病毒滴度相比差异不显著,脾和肾的差异显著.结论 NA119位点的定点突变对病毒的复制能力没有明显影响,突变株对BABL/c小鼠的致病力有一定增强,临床症状明显,神经氨酸酶活性下降.

目的 对广西犬只尤其是宠物犬中携带H9N2亚型流感病毒进行全基因组序列特征分析以及小鼠的致病性研究,为流感病毒疫情的防控提供科学依据.方法 采用RT-PCR的方法扩增、测序全基因组,DNAStar和MEGA6.0软件分析氨基酸同源性和进化树,通过小鼠感染实验探究其致病性.结果 13株H9N2毒株8个基因节段来源于5个不同谱系的毒株,属于新基因型,氨基酸同源性与广西分离株A/equine/Guangxi/3/2011≥99.0％,6个内部基因与2013年自人流感病毒分离株H7N9亲缘关系密切.毒株HA的裂解位点均为RSSR↓ GLF,表明低致病力.氨基酸位点HA226、NA119、NP375和PB2的701位等有变化,其中HA226位为亮氨酸L,具有与人SAα2,6-Gal结合的特性.BALB/c小鼠感染健康犬只中分离的H9N2病毒未在体内复制,而源自感冒犬只的毒株Ca/GX/8和Ca/GX/10能够在体内复制,临床症状明显但不致死.病毒经小鼠体内传代后致病力增强,推测是PB2的611位和PA623位氨基酸改变导致.结论 从广西各地犬只中获得的13株H9N2亚型流感病毒株经分析发现虽源于禽源,但具备和人源受体特异性结合的能力,且内部基因遗传进化关系复杂,对哺乳动物及人类存在较大威胁,亟需加强防控.

目的 对一株分离自广西兴安的猪源A(2009/H1N1)流感病毒进行遗传演化分析及致病性研究,为流感疫情防控提供科学依据.方法 通过SPF鸡胚进行流感病毒分离,对8个基因进行RT-PCR扩增、测序及进化分析;以6周龄雌性BALB/c小鼠为感染模型进行病毒滴定,分析临床数据评估病毒致病性.结果 分离的甲型H1N1病毒株A/swine/Guangxi/18/2013(H1N1) HA、NS和NP基因属于古典型H1N1,NA和M基因源于类禽型H1N1,PA和PB2基因归属禽源,PB1基因来自人源H3N2.HA裂解位点序列为PSIQSR↓ GLF,具有低致病性特征.以50μl 106 TCID50感染小鼠后其体重发生明显变化,最高体重平均变化率为86.98％,死亡率为12.5％;感染第3d测定肺、鼻甲病毒滴度(Log10 TCID50/ml)分别为5.25±0.28和3.89±0.47.结论 A/swine/Guangxi/18/2013(H1N1)为2009/H1N1流感病毒,能感染小鼠而造成体重下降并产生明显的临床症状.该病毒能在小鼠肺与鼻甲中进行复制,具有低致病性特征.

[目的]明确广西猪源H9N2亚型流感病毒的遗传特征及分子生物学特性(抗原性、耐药性和致病性),为广西猪源H9N2亚型流感病毒的防控提供科学依据.[方法]以分离自广西百色地区的2株猪源H9N2亚型流感病毒(SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株)为研究对象,运用RT-PCR扩增其全基因组的8个基因片段(HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因),经克隆测序后进行核苷酸序列及氨基酸位点分析.[结果]2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的核苷酸序列开放阅读框(ORF)分别是PB2:2280 bp、PB1:2274 bp、PA:2151 bp、HA:1683 bp、NP:1497 bp、NA:1410 bp、M:982 bp和NS:838 bp.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组仅M基因核苷酸序列与猪源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,而HA、NA、NP、NS、PA、PB2和PB1基因核苷酸序列均与禽源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,在基因型分类上属于G57基因型,为我国广泛流行的H9N2亚型基因型.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的HA蛋白发生R180Q、T213A、D216E、M224L、N285S和V287T突变,NA蛋白抗原决定簇S331V、W403S和Q431K也发生突变;NA蛋白在N2亚型的耐药性关键位点119E、151D、292R、276E和294N位点未发生突变,但在NA蛋白抗原区存在S331V、K367E和Q432K突变,且M2氨基酸位点发生S31N突变.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒HA蛋白连接HA1和HA2的氨基酸均为RSSR↓GLF;HA蛋白存在1个因P315S突变而新增的潜在糖基化位点(NCS);NA蛋白未缺失NA潜在糖基化位点,也未出现NA蛋白颈部杆状结构63～65 aa缺失现象,在NA潜在糖基化位点中69、86、146、200和234 aa处非常保守,但发生W402S突变.[结论]从广西百色分离获得的2株猪源H9N2亚型流感病毒(SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株)虽为低致病力毒株,但在流感病毒基因重组过程中发挥重要作用,且其致病性有增强趋势,已对金刚烷胺类药物产生耐药性.因此,应加强广西地区哺乳动物H9N2亚型流感病毒的监控,并警惕其跨种间传播.

[目的]了解广西H9 N2亚型猪源流感病毒的分子流行病学特征并揭示其遗传变化规律,为有效防控猪流感提供参考依据.[方法]运用PCR方法扩增广西2株H9N2亚型猪源流感病毒(A/swine/Guangxi/P2/2011和A/swine/Guangxi/P3/2011)的HA基因,并进行克隆测序及序列比对分析,绘制遗传进化树.[结果]2株H9N2亚型猪流感分离株的HA基因全长1701 bp,开放阅读框(ORF)全长1683 bp,编码560个氨基酸;与参考毒株核苷酸的同源性在83.7％～98.3％,推导氨基酸同源性在86.6％～98.2％.遗传进化树分析结果显示,2株分离株与A/Duck/HongKong/Y280/97病毒同属欧亚谱系的Y280亚系,其HA基因的裂解位点序列均为RSSR↓GLF,具有低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HA1区,2个位于HA2区;HA受体结合位点均具有人流感病毒和猪流感病毒特征.[结论]分离获得的广西2株H9N2亚型猪源流感病毒A/Swine/Guangxi/P2/2011和A/Swine/Guangxi/P3/2011,其HA基因属于欧亚普系的Y280亚系,均具备典型的低致病性和与人流感受体结合特征.

1 猪流感及其防控意义 猪流感(swine influenza,SI)呈世界性分布,各地均有流行,发病率高[1]. 猪流感能直接引起患病猪的死亡,并使患病猪的生长或生产不良,对养猪业的危害极大,研究表明康复猪和隐形感染猪是以后猪流感的传染源,猪流感作为一种主要的免疫抑制疾病,在猪场中普遍存在且难以根除[1,2].