目的:观察SOD融合蛋白对阿尔茨海默症(Alzheimer's Disease,AD)小鼠学习记忆能力及大脑氧化应激水平影响,探究小鼠行为改变与脑内氧化应激水平之间的关系.方法:选用32只KM雄性小鼠,适应性饲养7天后,随机分为4组:假手术组(S组),模型组(M组),SOD干预模型组(SM组)和SOD融合蛋白干预模型组(PM组).实验第8天进行Y迷宫和黑白箱测试,9-23天,通过小鼠连续腹腔内注射等量生理盐水(S和M组)、6 mg/kg SOD(SM组)或6 mg/kg SOD融合蛋白(PM组)进行预防干预.其中,实验第16天,通过5 μL微量注射器将生理盐水(S组,2 μL/只)及Aβ1-42寡聚体(M组、SM组及PM组,2μL/只)注射于小鼠右侧脑室,制备AD动物模型.第24天及31天进行Y迷宫和黑白箱测试.行为学测试结束后,随机选取一侧大脑半球用ELISA法测定脑组织匀浆中的SOD和MDA水平.结果:1)行为学测试:第8天,各处理组间差异无统计学意义,第24及第31天,与S组相比,M组小鼠Y迷宫新颖臂探索距离、探索次数及探索时间及黑白箱测试白箱探索距离、探索次数及探索时间均明显增加(P＜0.05);与M组相比,PM组小鼠Y迷宫新颖臂探索距离、探索次数及探索时间及白箱探索距离、探索次数及探索时间均明显减少(P＜0.05);SM组与M组相比差异无统计学意义.2)小鼠脑组织匀浆中SOD和MDA测定:与S组相比,M组SOD活性明显下降而MDA表达明显升高(P＜0.05),与M组相比,PM组SOD活性明显增加而MDA表达明显下降(P＜0.05),SM组与M组相比差异无统计学意义.3)SOD活性与Y迷宫新颖臂探索距离、探索次数和探索时间以及黑白箱中白箱探索距离、探索次数和探索时间呈负相关,而MDA表达与Y迷宫新颖臂探索距离、探索次数和探索时间以及黑白箱中白箱探索距离、探索次数和探索时间呈正相关.结论:SOD融合蛋白腹腔内注射可明显减轻Aβ1-42诱导的氧化应激及改善AD小鼠的行为恶化.SOD融合蛋白的抗氧化功能可能是预防AD的有效方法.

目的 探究皮肤外用PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白(简称SOD融合蛋白)在防治皮肤自然老化过程中的有效性及安全性.方法 将SOD融合蛋白乳膏按乳膏中SOD活力浓度分为单乳(0 U/cm2)、乳膏A(100 U/cm2)、乳膏B(300 U/cm2)、乳膏C(900 U/cm2),以单乳、乳膏C作小鼠去毛区皮肤外用干预,观察小鼠涂抹部位皮肤刺激性、致敏性及经皮毒性.健康6周龄昆明小鼠96只,随机分为6组,采用皮下注射D-半乳糖1 000 mg/kg连续42 d建立小鼠亚急性衰老模型,空白对照组(N组)皮下注射等体积的生理盐水.除N组、模型对照组(M组),余4组空白基质组(BM组),低剂量组(LD组),中剂量组(MD组),高剂量组(HD组)涂抹单乳、乳膏A、B、C于小鼠背部脱毛区,封闭6 h后清除残余,连续28 d后,每组取8只小鼠处死,观察脱毛区皮肤组织结构、SOD活性、MDA浓度以及弹性蛋白与胶原蛋白Ⅰ含量的改变,余小鼠继续D-半乳糖干预至42 d,标本留取同上.采用SPSS23.0对实验数据进行分析.结果 ①外用安全性试验中,以900 U/cm2活性浓度涂抹SOD融合蛋白乳膏,并未发现小鼠皮肤有红斑、水疱等致敏及刺激症状.经皮毒性试验中,涂抹单乳及乳膏C两组未出现小鼠死亡,且两组的血液学、血生化、脏器质量等指标差异无统计学意义(P＞0.05).②在自然老化试验中,与BM组相比,MD组、HD组小鼠皮毛浓密发亮、顺滑,皮肤结构清晰完整,真皮层明显增厚,且皮肤中MDA含量降低,SOD活力升高,真皮层弹性蛋白表达量增加(P＜0.05).结论 SOD融合蛋白乳膏在以900 U/cm2活性浓度涂抹下,具有较好的外用安全性.持续使用300 U/cm2的SOD融合蛋白乳膏,可有效改善小鼠表皮变薄、真皮结缔组织排列紊乱、纤维断裂等问题,可为临床上与年龄相关的皮肤老化及疾病的防治提供新的方法.

目的:观察超氧化物歧化酶(SOD)融合蛋白对阿尔茨海默病(AD)小鼠大脑白质超微结构的影响,探究大脑白质超微结构改变与脑内氧化应激水平之间的关系.方法:选用32只昆明雄性小鼠,适应性饲养7 d后,随机分为假手术组(S组)、模型组(M组)、SOD干预模型组(SM组)和SOD融合蛋白干预模型组(PM组),每组8只.在实验第9～23天,通过小鼠连续腹腔内注射等量0.9％氯化钠溶液(S和M组)、6 mg/(kg·d)SOD(SM组)或6 mg/(kg·d)SOD融合蛋白(PM组)进行预防干预.其中,在实验第16天,通过5μl微量注射器将0.9％氯化钠溶液(S组,2μl/只)及β-淀粉样蛋白(Aβ)1-42寡聚体(M组、SM组及PM组,2μl/只)注射于小鼠右侧脑室,以制备AD模型.在实验第32天,随机选取一侧大脑半球用ELISA法测定脑组织匀浆中的SOD活力和丙二醛(MDA)水平,另一侧大脑半球固定于2％甲醛+2.5％戊二醛溶液中,应用现代体视学方法定量分析小鼠脑白质及其超微结构变化.结果:四组小鼠在实验第8、24、31天体重比较差异无统计学意义(均P>0.05).M组SOD活力低于S组,PM组SOD活力高于M组(均P<0.05).M组MDA水平高于S组,PM组MDA水平低于M组(均P<0.05).M组小鼠脑白质总体积、有髓神经纤维总长度、有髓神经纤维总体积、髓鞘总体积低于S组,PM组小鼠脑白质总体积、有髓神经纤维总长度、有髓神经纤维总体积、髓鞘总体积高于M组(均P<0.05).M组小鼠髓鞘内直径及外直径低于S组,PM组小鼠髓鞘内直径及外直径高于M组(均P<0.05).一侧脑白质总体积、有髓神经纤维总长度、有髓神经纤维总体积、髓鞘总体积与脑组织匀浆中SOD活力呈正相关,而与MDA水平呈负相关(均P<0.05).结论:SOD融合蛋白外源性补充可明显减轻Aβ1-42诱导的氧化应激,改善AD小鼠脑白质及其超微结构变化.AD小鼠脑内氧化水平及白质超微结构改变之间有相关关系.

目的 优化PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体以增加SOD融合蛋白表达.方法 通过基因工程设计引物并优化PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体,扩增并鉴定目的基因,将优化后的原核重组表达载体以热激法转化至E.coli BL21(DE3)中,通过IPTG诱导重组载体进行蛋白表达,通过溶菌酶+超声裂解菌体,离心后收集上清,利用Ni-NTA树脂纯化,10 kD,20 kD透析袋浓缩,以获得SOD融合蛋白.利用SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot鉴定SOD融合蛋白.采用BCA与黄嘌呤氧化酶法测定SOD融合蛋白浓度及活力.结果 优化后的重组表达载体优化了稀有碱基,增加了His·Tag标签,His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD序列作为一个整体,在Nco I与BamH I限制性内切酶作用下定向插入,构建了长度为6213 bp的优化质粒,基因测序结果与预先设计的序列对比显示碱基序列正确.优化后的SOD融合蛋白表达量约占菌体的32％,较前(20％)提高,纯化浓缩后纯度为94％,较前(90％)增加.测定浓度为1.8 mg/ml,37℃时SOD总活力为(3065.137±19.75)U/mg prot.结论 通过重组表达载体密码子优化,可以获得高产量、高活性的SOD融合蛋白.