目的:对新建人胚肺细胞系(MU-L1)的生物学特性进行评价,以期建立可用于疫苗生产的人二倍体细胞株.方法:使用不同培养基及血清、不同血清浓度和传代比例培养MU-L1细胞,通过细胞形态、增殖速率和生长动力学等进行比较分析,筛选出较适宜的培养条件,用适宜的培养条件连续培养细胞至生命周期结束.传代过程中检查无菌、支原体和外源病毒因子,并进行染色体核型分析.结果:在常用培养基(MEM、DMEM、M199、DME/F12和PRMI1640)、胎牛血清和新生牛血清中MU-L1细胞均良好生长;按1 ∶ 4传代比例,使用含10％新生牛血清的MEM培养基培养,可培养至67代(世代),在生命周期的不同阶段经液氮冻存,复苏活率在91.56％～98.92％,生长良好.染色体核型为正常人二倍体核型,2n=46,无菌、支原体和外源病毒因子检查均为阴性.结论:MU-L1为正常人二倍体细胞系,具备作为病毒性疫苗基质进一步研究和生产应用的价值.

旨在筛选伪狂犬病病毒(PRV)敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21 悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺.本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID50病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证.结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3％血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖.利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×106cells·mL-1、搅拌转速120 r·min-1、DO值40％,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达(7.61±0.18)×106 cells·mL-1、细胞活率为(96.93±1.18)％.利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×106cells·mL-1、搅拌转速80 r·min-1,5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值(7.13±0.11)lgTCID50·mL-1.本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考.

[目的]探究不同浓度miR-2779表达水平变化对Bak1蛋白和mRNA表达的影响.[方法]将miR-2779模拟物(mimics)按照浓度分为30 nmol/L、50 nmol/L、75 nmol/L 和 100 nmol/L 组;抑制剂(inhibitor)分为75 nmol/L、100 nmol/L和120 nmol/L组,分别转染MDCK细胞,48 h后提取细胞总RNA,颈环法反转录miRNA,实时荧光定量PCR技术检测MDCK细胞中miR-2779和Bak1 mRNA表达水平,Western Blotting检测Bak1蛋白表达情况.[结果]与对照组相比,miR-2779 mimics转染组miR-2779表达水平均显著上调,75 nmol/L miR-2779 mimics转染组miR-2779显著上调 11.39±0.19倍(P＜0.001);75 nmol/L 和 100 nmol/L 组 Bak1 蛋白表达水平显著下调0.54±0.03、0.45±0.04倍;Bak1 mRNA表达水平均显著下调.miR-2779 inhibitor转染后75 nmol/L组miR-2779无显著变化,100 nmol/L 和 120 nmol/L 组显著下调0.621±0.03、0.649±0.03倍;100 nmol/L miR-2779 inhibitor 转染组中 Bak1 蛋白表达水平上调2.42±0.06倍.[结论]Bak1表达水平与miR-2779表达水平呈现负向调控,75 nmol/L miR-2779 mimics与100 nmol/L miR-2779 inhibitor为转染MDCK细胞的最佳浓度.miR-2779可调控MDCK细胞中的Bak1表达水平,可能通过其他凋亡信号通路上游因子调控Bak1表达,参与细胞凋亡过程.

细胞永生化使细胞能够在保持遗传性状的同时无限增殖,细胞的体外永生化需要将HPV的E6和E7基因、SV40的LT基因或人端粒酶逆转录酶(hTERT)等导入目标内,而SV40-LT是建立永生化细胞最便捷的基因.本试验利用慢病毒感染方式将SV40-LT导入MDCK细胞中,阳性筛选后经qPCR和免疫荧光实验均检测到SV40-LT的表达,成功建立了利用慢病毒方式导入SV40-LT的实验体系,为后续永生化细胞建系研究提供了技术依据.

为研究藏獒体细胞的生物学特性,保存藏獒遗传资源,以实验室前期自主分离的藏獒肾脏细胞为材料,探讨了其体外培养的形态特征、传代次数、冻存复苏、生长特性、细胞核型以及G418最低致死浓度.结果表明:藏獒肾脏细胞体外培养时形态均为成纤维细胞,形状梭形,呈放射状与旋涡状样式生长;细胞冻存后复苏活率为91％,且复苏后形态与长势均呈现良好状态;F1代至F5代,细胞增殖较快,F5代至F8代,细胞增殖减弱甚至停滞,细胞呈多边形状态,出现细胞脱落现象,最终于F8代无法继续生长;生长曲线测定结果显示,24孔板内细胞数目最高值达到4.06×105个/mL,最短倍增时间为27 h;藏獒核型2n=78;藏獒肾脏细胞的G418筛选最低致死浓度为500μg/mL.