为了建立一种准确快速的牛支原体(Mycoplasma bovis)抗体检测方法,对牛支原体P48 蛋白进行原核可溶性表达,采用SDS-PAGE、Western blot对蛋白进行鉴定,将鉴定正确的P48 重组蛋白作为抗原,对影响ELISA的各个因素进行方阵优化,建立间接ELISA检测方法,对其特异性、敏感性、重复性进行测试,并进行临床样品检测.结果显示:抗原包被浓度为 5 μg/mL,4℃包被过夜;10%马血清为最佳封闭液,封闭时间为2h;一抗最佳稀释度为1 ∶ 160,孵育时间为1h;酶标二抗最佳稀释度为1 ∶ 12 000,孵育时间为30 min;最佳显色时间为20 min.表达纯化的P48 蛋白可以与牛支原体血清、乳样发生特异反应,建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,与商品化牛支原体ELISA抗体检测试剂盒总体符合率为91.11%.结果表明,本研究建立了一种特异性、敏感性、重复性良好的牛支原体抗体间接ELISA检测方法,为牛支原体病防控及抗体水平检测提供了一种有效方法.

[目的]在毕赤酵母中构建禽腺病毒(FAdV)血清4型和8b型串联截短Fiber2-Fiber蛋白表达系统,并探索适宜的表达条件.[方法]以前期构建的重组质粒pCold-Fiber2-Fiber为模板,用PCR法扩增Fiber2-Fiber片段,连接pPICZαA载体.经双酶切和测序鉴定后的阳性重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber电转化毕赤酵母GS115.经MD平板和不同浓度Zeocin抗性筛选后进行PCR扩增和测序鉴定得到阳性菌株;用甲醇诱导表达阳性菌株,72 h后收集蛋白上清进行SDS-PAGE和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定.采用单因素变量法对不同pH(5.0、6.0、7.0和8.0)、甲醇浓度(0.5％、1.0％、1.5％和2.0％)、时间(24、48、72和96 h)进行表达条件优化,用SDS-PAGE鉴定,并用间接ELISA和Western blotting验证重组蛋白的反应原性.[结果]成功构建了重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber,对表达72 h后的上清进行SDS-PAGE发现1条约70 ku的特异条带,经LC-MS/MS鉴定为目的蛋白.串联截短Fiber2-Fiber蛋白的最优诱导条件为pH 6.0、1％甲醇、诱导时间72 h.间接ELISA和Western blotting结果显示该重组蛋白能与FAdV-4和FAdV-8b阳性血清特异性结合.[结论]Fiber2-Fiber串联截短蛋白可在毕赤酵母中稳定表达并具有良好的反应原性,为禽腺病毒双价亚单位疫苗的研发奠定基础.

为建立牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体间接ELISA检测方法,本研究对山东地区规模化奶牛场BVDV主要流行亚型的Erns蛋白进行表位分析,原核可溶表达优势抗原表位片段E6rn0s～145aa,经Western blot及LC-MS/MS鉴定后作为ELISA包被抗原,对影响ELISA试验的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性、重复性试验等.结果显示,间接ELISA方法优化后的条件为:0.25μg/mL抗原包被37℃2 h后4℃过夜,10％马血清封闭时间1.5 h,1:5稀释一抗孵育1.5 h,1:8000稀释二抗孵育60 min,显色25 min.该方法特异性、灵敏性及重复性良好,与商品化BVDV抗体检测试剂盒总体符合率为88.04％,符合率良好.本研究建立了一种特异性、灵敏性及重复性良好的BVDV抗体间接ELISA检测方法,为山东地区BVDV防控及临床检测提供了一种有效工具.

为建立可视化一步RT-LAMP检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法,根据GenBank中的BVDV的5'UTR序列,设计2组RT-LAMP引物,经过反应温度、反应时间、Mg2+和甜菜碱的终浓度的优化,特异性及灵敏性试验,对3种常用显色指示剂钙黄绿素-MnCl2、羟基萘酚蓝和中性红的显色效果进行评估,并使用商品化ELISA试剂盒与本方法进行对照试验.结果显示,经优化本方法在66℃30 min即可完成反应,采用中性红作为显色指示剂,检测BVDV可产生特异阳性反应;对BVDV RNA检测下限最低达0.021 pg/μL;对13份临床样品检测结果与商品化ELISA检测试剂盒相符率100％.结果表明,所建立的BVDV可视化一步RT-LAMP检测方法的特异性、灵敏性较好,可为BVDV临床快速检测提供帮助.

为了解山东部分地区奶牛副结核病的感染情况,采用ELISA方法对2018年2月-2019年11月期间山东省9个地区18个不同规模奶牛养殖场2岁以上所有泌乳奶牛进行副结核病的血清抗体水平检测,并运用统计学软件进行数据分析.结果显示,2018年2月-2019年11月期间山东省9个地区总体抗体阳性率为17.80％(579/3253),2019年阳性率(22.31％;441/1976)高于2018年阳性率(11.24％,138/1227).不同地区和不同月份的抗体阳性率差异均较大,济南地区最高,为40.75％(P>0.05),威海地区最低,为5.98％(P>0.05);济南与其他地区抗体阳性率均差异显著(P<0.05),威海与潍坊差异不显著(P>0.05),与其他地区差异显著(P<0.05);8月份最高为80.00％,2月份最低,为6.27％.不同饲养规模的抗体阳性率由高到低依次为中型牛场20.14％(P>0.05)、大型牛场15.57％(P>0.05)、小型牛场15.30％(P>0.05),不同规模的养殖场之间牛副结核病阳性率均差异不显著(P>0.05).此次调查表明,牛副结核感染在山东省普遍存在,应引起有关部门的重视,采取有效的综合防控措施进行防控.

为了了解2018年4月-2019年12月山东省部分地区规模化奶牛场牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染情况,采用商品化酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒对山东省13个地市5901份送检样品进行了BVDV抗原检测,879份送检样品(823份血样、56份大缸奶样)进行了BVDV抗体检测.结果 显示,所检BVDV抗原样本总阳性率为0.49％、血样BVDV抗体样本总阳性率为75.94％、大缸奶BVDV抗体样本总阳性率为94.64％.菏泽地区BVDV抗原样本阳性率最高,为1.07％;滨州地区血样BVDV抗体样本阳性率最高,为96.77％;德州、聊城、潍坊、日照、威海、泰安地区均在送检奶样中检测到BVDV抗体,样本阳性率达100％.2018年4-6月送检样品BVDV抗原阳性率最高,为1.94％;2019年1-3月送检血样BVDV抗体阳性率最高,为90.91％.中规模牧场送检样品BVDV抗原阳性率最高,为0.79％;大规模牧场送检血样BVDV抗体阳性率最高,为84.47％.结果 表明山东地区BVDV的感染情况较为严重,存在地域和季节性差异,应引起有关单位高度重视,本调查以期为山东省牛病毒性腹泻病毒的防控与净化提供帮助.

现代肉鸡规模化养殖模式下肉鸡场安全用药至关重要,用药安全与否关系到肉鸡的生命安全、生产力的高低、产品质量的优劣和环境保护.本文章对大量规模化肉鸡场进行了调查,对规模化肉鸡场常用化学药物和中药种类、不同药物的用药原则、不同用药模式等进行了综述.