Necrotic enteritis (NE) is a potentially fatal poultry disease that causes enormous economic losses in the poultry industry worldwide. The study aimed to evaluate the effects of dietary organic yeast-derived selenium (Se) on immune protection against experimental necrotic enteritis (NE) in commercial broilers. Chickens were fed basal diets supplemented with different Se levels (0.25, 0.50, and 1.00 Se mg/kg). To induce NE, Clostridium perfringens (C. perfringens) was orally administered at 14 days of age post hatch. The results showed that birds fed 0.25 Se mg/kg exhibited significantly increased body weight gain compared with the non-supplemented/infected birds. There were no significant differences in gut lesions between the Se-supplemented groups and the non-supplemented group. The antibody levels against α-toxin and NetB toxin increased with the increase between 0.25 Se mg/kg and 0.50 Se mg/kg. In the jejunal scrapings and spleen, the Se-supplementation groups up-regulated the transcripts for pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-6, IL-8, iNOS, and LITAF and avian β-defensin 6, 8, and 13 (AvBD6, 8 and 13). In conclusion, supplementation with organic yeast-derived Se alleviates the negative consequences and provides beneficial protection against experimental NE.

为了建立一种准确快速的牛支原体(Mycoplasma bovis)抗体检测方法,对牛支原体P48 蛋白进行原核可溶性表达,采用SDS-PAGE、Western blot对蛋白进行鉴定,将鉴定正确的P48 重组蛋白作为抗原,对影响ELISA的各个因素进行方阵优化,建立间接ELISA检测方法,对其特异性、敏感性、重复性进行测试,并进行临床样品检测.结果显示:抗原包被浓度为 5 μg/mL,4℃包被过夜;10%马血清为最佳封闭液,封闭时间为2h;一抗最佳稀释度为1 ∶ 160,孵育时间为1h;酶标二抗最佳稀释度为1 ∶ 12 000,孵育时间为30 min;最佳显色时间为20 min.表达纯化的P48 蛋白可以与牛支原体血清、乳样发生特异反应,建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,与商品化牛支原体ELISA抗体检测试剂盒总体符合率为91.11%.结果表明,本研究建立了一种特异性、敏感性、重复性良好的牛支原体抗体间接ELISA检测方法,为牛支原体病防控及抗体水平检测提供了一种有效方法.

[目的]在毕赤酵母中构建禽腺病毒(FAdV)血清4型和8b型串联截短Fiber2-Fiber蛋白表达系统,并探索适宜的表达条件.[方法]以前期构建的重组质粒pCold-Fiber2-Fiber为模板,用PCR法扩增Fiber2-Fiber片段,连接pPICZαA载体.经双酶切和测序鉴定后的阳性重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber电转化毕赤酵母GS115.经MD平板和不同浓度Zeocin抗性筛选后进行PCR扩增和测序鉴定得到阳性菌株;用甲醇诱导表达阳性菌株,72 h后收集蛋白上清进行SDS-PAGE和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定.采用单因素变量法对不同pH(5.0、6.0、7.0和8.0)、甲醇浓度(0.5％、1.0％、1.5％和2.0％)、时间(24、48、72和96 h)进行表达条件优化,用SDS-PAGE鉴定,并用间接ELISA和Western blotting验证重组蛋白的反应原性.[结果]成功构建了重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber,对表达72 h后的上清进行SDS-PAGE发现1条约70 ku的特异条带,经LC-MS/MS鉴定为目的蛋白.串联截短Fiber2-Fiber蛋白的最优诱导条件为pH 6.0、1％甲醇、诱导时间72 h.间接ELISA和Western blotting结果显示该重组蛋白能与FAdV-4和FAdV-8b阳性血清特异性结合.[结论]Fiber2-Fiber串联截短蛋白可在毕赤酵母中稳定表达并具有良好的反应原性,为禽腺病毒双价亚单位疫苗的研发奠定基础.

为建立牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体间接ELISA检测方法,本研究对山东地区规模化奶牛场BVDV主要流行亚型的Erns蛋白进行表位分析,原核可溶表达优势抗原表位片段E6rn0s～145aa,经Western blot及LC-MS/MS鉴定后作为ELISA包被抗原,对影响ELISA试验的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性、重复性试验等.结果显示,间接ELISA方法优化后的条件为:0.25μg/mL抗原包被37℃2 h后4℃过夜,10％马血清封闭时间1.5 h,1:5稀释一抗孵育1.5 h,1:8000稀释二抗孵育60 min,显色25 min.该方法特异性、灵敏性及重复性良好,与商品化BVDV抗体检测试剂盒总体符合率为88.04％,符合率良好.本研究建立了一种特异性、灵敏性及重复性良好的BVDV抗体间接ELISA检测方法,为山东地区BVDV防控及临床检测提供了一种有效工具.

为建立可视化一步RT-LAMP检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法,根据GenBank中的BVDV的5'UTR序列,设计2组RT-LAMP引物,经过反应温度、反应时间、Mg2+和甜菜碱的终浓度的优化,特异性及灵敏性试验,对3种常用显色指示剂钙黄绿素-MnCl2、羟基萘酚蓝和中性红的显色效果进行评估,并使用商品化ELISA试剂盒与本方法进行对照试验.结果显示,经优化本方法在66℃30 min即可完成反应,采用中性红作为显色指示剂,检测BVDV可产生特异阳性反应;对BVDV RNA检测下限最低达0.021 pg/μL;对13份临床样品检测结果与商品化ELISA检测试剂盒相符率100％.结果表明,所建立的BVDV可视化一步RT-LAMP检测方法的特异性、灵敏性较好,可为BVDV临床快速检测提供帮助.

为建立我校家畜寄生虫电子标本库并评价其使用效果,将我校现有的家畜寄生虫浸制标本和玻片标本等实物标本通过扫描、数码照相、显微照相和录像等技术手段制作成影像,建立了一个基本覆盖教学用代表虫种的库容为1650张电子图片的电子标本库,在此基础上,建立了对电子标本快速查阅的检索系统.将电子标本库和检索系统应用到家畜寄生虫学的理论和实验教学中,取得了良好的教学效果,提高了教学质量.

为了解山东部分地区奶牛副结核病的感染情况,采用ELISA方法对2018年2月-2019年11月期间山东省9个地区18个不同规模奶牛养殖场2岁以上所有泌乳奶牛进行副结核病的血清抗体水平检测,并运用统计学软件进行数据分析.结果显示,2018年2月-2019年11月期间山东省9个地区总体抗体阳性率为17.80％(579/3253),2019年阳性率(22.31％;441/1976)高于2018年阳性率(11.24％,138/1227).不同地区和不同月份的抗体阳性率差异均较大,济南地区最高,为40.75％(P>0.05),威海地区最低,为5.98％(P>0.05);济南与其他地区抗体阳性率均差异显著(P<0.05),威海与潍坊差异不显著(P>0.05),与其他地区差异显著(P<0.05);8月份最高为80.00％,2月份最低,为6.27％.不同饲养规模的抗体阳性率由高到低依次为中型牛场20.14％(P>0.05)、大型牛场15.57％(P>0.05)、小型牛场15.30％(P>0.05),不同规模的养殖场之间牛副结核病阳性率均差异不显著(P>0.05).此次调查表明,牛副结核感染在山东省普遍存在,应引起有关部门的重视,采取有效的综合防控措施进行防控.

为了了解2018年4月-2019年12月山东省部分地区规模化奶牛场牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染情况,采用商品化酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒对山东省13个地市5901份送检样品进行了BVDV抗原检测,879份送检样品(823份血样、56份大缸奶样)进行了BVDV抗体检测.结果 显示,所检BVDV抗原样本总阳性率为0.49％、血样BVDV抗体样本总阳性率为75.94％、大缸奶BVDV抗体样本总阳性率为94.64％.菏泽地区BVDV抗原样本阳性率最高,为1.07％;滨州地区血样BVDV抗体样本阳性率最高,为96.77％;德州、聊城、潍坊、日照、威海、泰安地区均在送检奶样中检测到BVDV抗体,样本阳性率达100％.2018年4-6月送检样品BVDV抗原阳性率最高,为1.94％;2019年1-3月送检血样BVDV抗体阳性率最高,为90.91％.中规模牧场送检样品BVDV抗原阳性率最高,为0.79％;大规模牧场送检血样BVDV抗体阳性率最高,为84.47％.结果 表明山东地区BVDV的感染情况较为严重,存在地域和季节性差异,应引起有关单位高度重视,本调查以期为山东省牛病毒性腹泻病毒的防控与净化提供帮助.

为构建鸡源抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-4)单链抗体(scFv)文库并筛选出具有高亲和力的单链抗体.本研究从FAdV-4免疫鸡的外周血淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法分别扩增出鸡抗体的VH和VL基因,通过Linker接头将VH和VL基因连接成scFv,将scFv基因连接至噬菌粒载体pComb3XSS中,构建单链抗体文库,通过噬菌体展示技术筛选抗FAdV-4单链抗体,并采用Phage ELISA方法检测抗体的亲和力.结果 成功构建鸡源抗FAdV-4单链抗体文库,库容量为9.5×1010 PFU/mL,通过4轮“吸附-洗脱-富集”筛选,最终鉴定出1株与FAdV-4具有较高的亲和活性的单链抗体.该研究结果为进一步研究FAdV-4抗体奠定了基础.

为了解近年来鸡细小病毒(ChPV)流行毒株的全基因组基因特征和分子进化规律,本研究对2018年从山东潍坊和河南濮阳肠炎综合征病例中检测到的2株ChPV-SDWF和ChPV-HNPY进行了基因组克隆和序列测定.应用MEGA 5.02、SimPlot 3.5.1、Phyre 2等生物信息学软件对基因结构、遗传变异、重组情况及VP2蛋白3D结构进行了分析.结果显示,2株分离株基因组序列长度均为4 615 bp,核苷酸同源性为96.9％;ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株与不同参考株的核苷酸同源性分别为80.6％～95.7％、80.1％～95.4％.2株分离株与美国火鸡细小病毒参考株TuPV-260株和匈牙利ChPV参考株ChPV-ABU-Pl亲缘关系较近,属于同一个分支.分离株没有出现重组现象,核苷酸同源性由高到低依次为NS1基因、VP1基因、VP2基因.VP2蛋白3D结构含有8条反向平行的β折叠围成的桶,表面存在4个Loop,其中Loop3和Loop4变异最大.本研究可进一步了解我国ChPV的基因特征和遗传变异情况,为ChPV的监测及防控提供理论依据.

为了了解血清4型Ⅰ群禽腺病毒(serotype 4 of group Ⅰ Fowl adenovirus)分离株RZ140718(RZ株)的hexon、penton、fiber-1和fiber-2四个主要结构蛋白的遗传进化、二级结构及抗原表位等生物学信息,试验在对四个蛋白基因扩增测序基础上,应用Megalign、MEGA 5.1软件进行氨基酸序列分析并构建系统发育进化树,应用ProtParam、SignalP和SOPMA软件分析理化性质和二级结构,应用BepiPred、ABCpred、IEDB和DNAStar软件综合预测B细胞抗原表位,应用NetMHCpan4.0和NetMHC Ⅱpan3.2软件预测T细胞抗原表位.结果 表明:从RZ株中PCR扩增出hexon、penton、fiber-1和fiber-2这四个蛋白的基因;RZ株的hexon和penton蛋白与GenBank中12个血清型参考株的同源性较高,fiber-1和fiber-2蛋白与4型和10型参考株的同源性较高;RZ株的四个蛋白与GenBank中其他4型中国分离株均位于同一分支上;四个蛋白均为酸性亲水蛋白,无信号肽,均以无规卷曲为主;从四个蛋白中分别得到22,11,11,10个潜在的线性B细胞抗原表位,4,2,4,2个潜在的CTL细胞抗原表位,2,1,1,0个潜在的Th细胞抗原表位.说明hexon蛋白具有较多的潜在优势抗原表位,可用于后续表位疫苗的开发研究.

现代肉鸡规模化养殖模式下肉鸡场安全用药至关重要,用药安全与否关系到肉鸡的生命安全、生产力的高低、产品质量的优劣和环境保护.本文章对大量规模化肉鸡场进行了调查,对规模化肉鸡场常用化学药物和中药种类、不同药物的用药原则、不同用药模式等进行了综述.

为探讨银黄可溶性粉体外抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-4)的活性,应用MTT法与CPE法测定银黄可溶性粉对LMH细胞贴壁和单层生长的最大安全浓度,研究其对病毒增殖抑制、感染阻断和直接灭活的作用效果.结果 显示,银黄可溶性粉对LMH细胞最大安全浓度为156.25 μg/mL,在安全浓度范围内,加药组LMH细胞贴壁和细胞单层形成与细胞对照组无显著差异(P＞0.05).156.25 μg/mL银黄可溶性粉体外抗FAdV-4效果最好,病毒增殖抑制、病毒感染阻断和直接灭活试验的细胞存活率分别为96.1％、122.0％、99.7％,病毒抑制率分别为91.5％、143.8％、99.3％,均显著高于病毒对照组(P＜0.05).此外,78.13 μg/mL和156.25 μg/mL的银黄可溶性粉体在病毒感染阻断试验中具有促进细胞生长作用.本研究为银黄可溶性粉用于因FAdV-4引起的鸡心包积液综合征的临床治疗提供理论依据.

为了给犬副流感病毒(CPIV)疫苗研制提供支持,无菌采集有呼吸道症状病死犬的脑和肺脏样品,处理后接种Marc-145细胞,通过RT-PCR、红细胞吸附试验,对盲传3代的细胞培养液进行鉴定,成功分离到1株CPIV.该病毒能使Marc-145细胞出现细胞病变,且具有吸附鸡红细胞的能力,将其命名为CPIV-D 121004株.对该毒株的F糖蛋白全基因进行克隆及核苷酸同源性分析并构建遗传进化树,发现分离株的F基因较为保守,未出现大的遗传变异.今后需要对分离株的免疫原性进行研究,以探究其作为候选疫苗株的潜力.

为满足兽用生物制品免疫攻毒试验需求,参照实验动物设施建设相关国家标准及生物安全实验室建筑技术规范,设计和建设了一个双走廊模式、屏障环境、符合生物安全二级要求的动物生物安全二级实验室(ABSL-2),可满足使用清洁级以上的实验动物进行的感染性试验的需求.本文针对ABSL-2的设施设计要点、生物安全控制等相关理念和内容进行了阐述,强调建设过程应高度关注生物安全防护问题,以期为建设相关单位建设实验室提供信息参考.

为建立迟缓爱德华氏菌的快速检测方法,本研究根据迟缓爱德华氏菌溶血相关基因eha设计保守引物,建立迟缓爱德华氏菌快速、可视化核酸试纸条检测技术.试验结果显示,该技术快速、灵敏、具有良好的特异性,灵敏度可达到30 CFU/mL,比琼脂糖凝胶成像检测技术灵敏度要高近10倍.迟缓爱德华氏菌可视化核酸试纸条检测方法的成功建立对水产养殖过程中迟缓爱德华氏菌病防治具有重要的意义.

The present study was performed to detect and characterize the serotypes of fowl adenovirus associated with inclusion body hepatitis (IBH) or hepatitis-hydropericardium syndrome (HHS) in commercial poultry in some regions of China between 2007 and 2017. Approximately 81 fowl adenovirus strains were isolated from liver or kidney samples from diseased poultry. A sequencing analysis of the hexon loop 1 gene revealed fowl adenovirus serotypes 8a, 8b, and 11 in samples of broilers with IBH, serotype 11 in layers with IBH, and serotype 4 in poultry with HHS. Of the fowl adenovirus serotype 4 strains, 62.07% were isolated from layers. Additionally, 74.07% of the isolated strains were fowl adenovirus serotype 11 prior to June 2014; 53.70% were serotype 4 after that time point; and strains isolated in the first half of 2017 were all serotype 8b, which was related to the widespread application of inactivated serotype 4 adenovirus vaccines. These results demonstrate that fowl adenovirus serotypes 11, 4, and 8b were the predominant serotypes in some regions of China between 2007 and June 2014, between June 2014 and 2016, and in the first half of 2017, respectively. Layers were the predominant host infected with fowl adenovirus serotype 4 and could also be infected by serotype 11.

为了解我国Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)主要流行血清型hexon蛋白序列和抗原表位的差异,对43株FAdV-Ⅰ分离株的hexon进行了序列和遗传进化分析,利用DNAStar中Protean预测了4个流行血清型代表株hexon蛋白的抗原表位.结果显示:同型分离株间hexon氨基酸序列同源性高,其中FAdV-4分离株的氨基酸序列同源性为100％.hexon蛋白氨基酸序列在第132～289位、第363～507位和第793～878位存在3个主要可变区,分别对应于hexon的L1、L2和L4区.在FAdV-11中,分离株QDPD100808和YTLY081010氨基酸序列在第97-138位区段发生缺失,分离株HNQX120913在第693-720位突变为HVQEHERALRHVHQLARERPVASTQPVS.预测到FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11的代表株hexon蛋白分别有40、37、38和37个抗原表位,FAdV-4的特异性抗原表位最多,为16个,FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11特异性抗原表位较少,分别为3个、6个和3个.研究结果为我国FAdV-Ⅰ主要流行血清型基于hexon基因的诊断提供了理论依据.

球虫病(coccidiosis)是一种严重危害养殖业的寄生虫病,各种动物群体均有发生,其中以鸡球虫病(chicken coccidiosis)危害最严重,每年造成严重的经济损失[1-2].目前,国内对鸡球虫病的研究主要集中于以下几个方面:鸡球虫病的防治措施、球虫虫株耐药性检测、抗鸡球虫药物的研发以及球虫虫苗的筛选和制备[3-5].我国三大数据库(中国知网、万方数据、维普网)检索结果显示每年发表鸡球虫病相关文章数量在300篇左右.

为了解我国Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)主要流行血清型FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11之间的交叉中和情况,试验选取4种流行血清型的代表株,制备其对应的血清型单因子血清并进行细胞交叉中和试验.结果表明:4种血清型都能对自身病毒产生中和作用,其中RZ140718(FAdV-4)血清还能中和YT160809(FAdV-11),JL150226(FAdV-8b)和YT160809(FAdV-11)之间还能互相中和.说明FAdV-Ⅰ不同流行血清型间交叉中和情况复杂.