Применение ингибиторов тирозинкиназ позволило добиться существенного успеха в терапии хронической миелогенной лейкемии, однако поиск новых мишеней для терапии этого заболевания по-прежнему остается актуальной задачей. Известно, что в линии клеток К562 хронической миелогенной лейкемии человека экспрессируются протон-управляемые ионные каналы ASIC1, которые являются молекулярной мишенью трехпетельных токсинов из яда черной мамбы ( Dendroaspis polylepis ) – мамбалгинов. Мамбалгины эффективно ингибируют гомо- и гетеромерные рецепторы, содержащие субъединицу ASIC1a, однако возможность их использования в качестве противоопухолевых агентов ранее не исследовалась. С помощью метода патч-кламп нами впервые обнаружена активация протон-управляемых ионных каналов ASIC1a в клетках К562 в ответ на снижение внеклеточного рН. Показано, что рекомбинантный мамбалгин-2 ингибирует активность ASIC1a и тормозит пролиферацию клеток К562 с полумаксимальной эффективной концентрацией ЕС 50 ~ 0.2 мкМ. Максимальный ингибирующий эффект мамбалгина-2 достигается после 72-часовой инкубации с клетками и при достижении рН клеточной среды ~ 6.6. В клетках К562 мамбалгин-2 вызывает арест клеточного цикла в фазе G1 и снижает фосфорилирование регуляторов фазы G1 клеточного цикла – циклина D1 и циклинзависимой киназы CDK4, не влияя на активацию киназы CDK6. Полученные результаты свидетельствуют о возможности создания на основе мамбалгина-2 новых противолейкозных препаратов.

Показано, что рекомбинантный аналог белка SLURP‑1 эффективно останавливает рост 3D‑моделей опухолей - мультиклеточных сфероидов, полученных из клеток карциномы кожи человека А431 и аденокарциномы лёгкого человека А549. Совместное применение препарата SLURP‑1 с гефитинибом (ингибитор рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR)) приводит к аддитивному антипролиферативному эффекту на сфероидах из клеток А431. Полученные данные свидетельствуют о возможности создания первого в своём классе противоопухолевых средств на основе рекомбинантного SLURP‑1.

Представлены данные по экспрессии гена эндогенного нейромодулятора человека SLURP-1, действующего на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, и принадлежащего к семейству белков Ly-6/uPAR. Созданы конструкции для цитоплазматической продукции SLURP-1 в клетках E. coli в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином и для секреции с лидерным пептидом STII. Однако получить SLURP-1 в миллиграммовых количествах удалось только в составе цитоплазматических телец включения. Опробованы различные подходы для ренатурации нейромодулятора. Получены миллиграммовые количества рекомбинантного SLURP-1 и его 15N-меченого аналога. Показано, что в микромолярных концентрациях SLURP-1 конкурирует с [125I]-?-бунгаротоксином за связывание с мышечным никотиновым ацетилхолиновым рецептором из Torpedo californica. Полученные результаты указывают на возможное перекрывание сайтов связывания нейромодулятора и ?-нейротоксинов на поверхности нАХР. Методом ЯМР-спектроскопии установлено, что в водном растворе присутствуют две равнозаселенные структурные формы SLURP-1. Показано, что конформационная гетерогенность в молекуле нейромодулятора вызвана цис-транс изомерией пептидной связи Tyr39-Pro40, и характерное время обменного процесса между двумя формами составляет ~4 мс. Получено отнесение 1H и 15N ЯМР сигналов, и определена вторичная структура обеих структурных форм SLURP-1. Согласно полученным данным, структура нейромодулятора включает в себя два антипараллельных ?-листа, состоящих из пяти ?-тяжей и имеет близкое сходство со структурами трехпетельных нейротоксинов яда змей.

Е. Н. Люкманова, З. О. Шенкарев, Н. Ф. Хабибуллина, Д. С. Кульбацкий, М. А. Шулепко, Л. Е. Петровская, А. С. Арсеньев, Д. А. Долгих, М. П. Кирпичников Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова рАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 *E-mail: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru Поступила в редакцию 31.08.2012

alpha-Neurotoxins from snake venom are highly efficient inhibitors of nicotinic acetylcholine receptors (nAChR). These small proteins that have a beta-structural organization attract much interest as a tool for studies of nACh R and as prototypes for the development of new Pharmaceuticals for the treatment of diseases of the nervous system. However, the in vitro production of "three-finger" neurotoxins is complicated by the presence of four or five disulfide bonds that are closely located in their molecules. The present review contains a description of the most frequently used modern approaches for the E. coli expression of recombinant proteins (direct expression, expression as fusions, and secretion) with an emphasis placed on the recombinant production of snake alpha-neurotoxins. The methods of E. coli expression of isotopically labeled neurotoxins are described. The proposed solutions will be of broad interest for the bacterial production of other disulfide-abundant proteins.

Экспрессирован ген «слабого» токсина из яда кобры Naja kaouthia. «Слабый» токсин является специфичным ингибитором никотинового ацетилхолинового рецептора, однако механизмы взаимодействия подобных нейротоксинов с рецептором на данный момент остаются неизвестными. Для бактериальной продукции «слабого» токсина из яда кобры N. kaouthia опробованы системы, разработанные ранее для нейроток-сина II из яда кобры N. oxiana. Созданы конструкции для цитоплазматической продукции «слабого» токсина из яда кобры N. kaouthia в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином и для секреции с лидер-ным пептидом STII. Однако получить «слабый» токсин в миллиграммовых количествах удалось только в составе цитоплазматических телец включения. Опробованы различные подходы для ренатурации токсина и проведен поиск условий оптимизации выхода целевого белка в процессе ренатурации. Полученный белок охарактеризован методами масс-спектроскопии, КД- и ЯМР-спектроскопии. Эксперименты по конкурентному ингибированию связывания [1251]б-бунгаротоксина с мембранами электрического органа ската Torpedo californica, содержащими никотиновый ацетилхолиновый рецептор мышечного типа (б12Я1гд), показали наличие биологической активности рекомбинантного «слабого» токсина, близкой к активности природного токсина (IC50 4,3 ± 0,3 и 3,0 ± 0,5 мкМ соответственно). Взаимодействие рекомбинантного токсина с нейрональным никотиновым ацетилхолиновым рецептором человека а7 типа, трансфецированным в клеточной линии GH4C1, также показало наличие активности, близкой к таковой природного токсина (IC50 31 ± 5 и 14,8 ± 1,3 мкМ соответственно). Разработанная бактериальная система продукции «слабого» токсина из яда кобры N. kaouthia позволила получить 15N-меченный аналог «слабого» токсина.

Neurotoxin II from the venom of cobra Naja oxiana is a short type alpha-neurotoxin, which competitively inhibits nicotinic acetylcholine receptor. The toxin gene was expressed as a construct fused with the thioredoxin gene and the linker encoding the enteropeptidase recognition site and a Met residue between the genes. The fusion protein was mainly cleaved by cyanogen bromide, since enteropeptidase was less effective. The yield of neurotoxin II was 6 mg/l of the bacterial culture. The resulting recombinant protein was identified with native neurotoxin II by its N-terminal analysis, mass spectrometry, and NMR spectroscopy. The English version of the paper: Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2004, vol. 30, no. 1; see also http://www.maik.ru.