Из яда скорпиона Heterometrus laoticus выделены низкомолекулярные соединения, обладающие антикоагулянтной активностью. Исследование структуры выделенных соединений методами ядерного магнитного резонанса и масс-спектрометрии показало, что одно из них является аденозином, а два других представляют собой дипептиды лейцил-триптофан и изолейцил-триптофан. Наличие в яде скорпиона лейцил-триптофана и изолейцил-триптофана и их способность замедлять свёртывание крови установлены впервые.

Представлены данные по экспрессии гена эндогенного нейромодулятора человека SLURP-1, действующего на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, и принадлежащего к семейству белков Ly-6/uPAR. Созданы конструкции для цитоплазматической продукции SLURP-1 в клетках E. coli в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином и для секреции с лидерным пептидом STII. Однако получить SLURP-1 в миллиграммовых количествах удалось только в составе цитоплазматических телец включения. Опробованы различные подходы для ренатурации нейромодулятора. Получены миллиграммовые количества рекомбинантного SLURP-1 и его 15N-меченого аналога. Показано, что в микромолярных концентрациях SLURP-1 конкурирует с [125I]-?-бунгаротоксином за связывание с мышечным никотиновым ацетилхолиновым рецептором из Torpedo californica. Полученные результаты указывают на возможное перекрывание сайтов связывания нейромодулятора и ?-нейротоксинов на поверхности нАХР. Методом ЯМР-спектроскопии установлено, что в водном растворе присутствуют две равнозаселенные структурные формы SLURP-1. Показано, что конформационная гетерогенность в молекуле нейромодулятора вызвана цис-транс изомерией пептидной связи Tyr39-Pro40, и характерное время обменного процесса между двумя формами составляет ~4 мс. Получено отнесение 1H и 15N ЯМР сигналов, и определена вторичная структура обеих структурных форм SLURP-1. Согласно полученным данным, структура нейромодулятора включает в себя два антипараллельных ?-листа, состоящих из пяти ?-тяжей и имеет близкое сходство со структурами трехпетельных нейротоксинов яда змей.

Рецепторные тирозинкиназы – интегральные мембранные белки, которые активируются при латеральной гомо- или гетеродимеризации, осуществляемой с участием их трансмембранного домена. Рецепторные тирозинкиназы играют важную роль в передаче межклеточного сигнала, а полиморфизм и мутации в их трансмембранных доменах ассоциированы с рядом заболеваний человека. Семейство рецепторов эпидермального фактора роста, ErbB, представляет собой важный класс рецепторных тирозинкиназ, которые участвуют в процессах роста, развития и дифференцировки клеток человека. В настоящей работе для изучения влияния патогенных мутаций на структурно-динамические свойства и специфическое взаимодействие трансмембранных доменов рецепторов семейства ErbB созданы высокоэффективные системы бактериальной экспрессии и очистки рекомбинантных трансмембранных фрагментов ErbB2641-684 с проонкогенными заменами остатка Val659 на остатки Glu или Gln. Трансмембранные фрагменты нарабатывали в клетках Escherichia coli BL21(DE3)pLysS в составе гибрида с тиоредоксином А. Протокол выделения и очистки включает металлохелатную аффинную и катионообменную хроматографии. Использование тромбина для гидролиза гибридного белка позволяет снизить финансовые затраты по сравнению с аналогичными протоколами. Описанные методики позволяют получить миллиграммовые количества мутантных трансмембранных фрагментов ErbB, а также их изотопно-меченых производных для структурных исследований методом гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения в мембраноподобном окружении.

Е. Н. Люкманова, З. О. Шенкарев, Н. Ф. Хабибуллина, Д. С. Кульбацкий, М. А. Шулепко, Л. Е. Петровская, А. С. Арсеньев, Д. А. Долгих, М. П. Кирпичников Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова рАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 *E-mail: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru Поступила в редакцию 31.08.2012

РЕФЕРАТ Для адекватной терапии болезни Альцгеймера, которая поражает людей во всем мире независимо от национальности и социально-экономического статуса, необходимо понимать молекулярные основы патогенеза этого заболевания. Амилоидный β-пептид, формирующий амилоидные бляшки в головном мозге при болезни Альцгеймера, образуется в результате последовательного расщепления мембранного белкапредшественника β-амилоида (amyloid precursor protein – APP). Более половины мутаций APP, обнаруженных при семейных формах болезни Альцгеймера, локализованы в его трансмембранном домене. Патогенные мутации, как предполагают, влияют на структурно-динамические свойства трансмембранного домена APP, изменяя его конформационную стабильность и/или латеральную димеризацию. В настоящей работе методами ЯМР-спектроскопии в среде, имитирующей мембранное окружение, – детергентных мицеллах, определены пространственная структура и динамика рекомбинантного пептида, соответствующего фрагменту APP Gln686–Lys726, который включает трансмембранный домен APP с прилегающим N-концевым примембранным участком. Структура, полученная в мицеллах додецилфосфохолина, представляет собой две α-спирали: короткая амфифильная примембранная Lys687–Asp694 и длинная трансмембранная Gly700– Leu723, соединенные подвижным петлевым участком. В районе спаренных остатков Gly708–Gly709 наблюдается небольшое искривление трансмембранной α-спирали. Под петлевым участком в области контакта примембранной α-спирали с поверхностью мембраны рядом с N-концом трансмембранной α-спирали, повидимому, образуется гидрофобная полость, предназначенная для взаимодействия APP с холестерином. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА болезнь Альцгеймера, белок-предшественник β-амилоида, трансмембранный домен, ЯМР-спектроскопия, пространственная структура, динамика. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ APP – белок-предшественник β-амилоида (amyloid precursor protein); Aβ – амилоидный β-пептид; ТМ – трансмембранный (transmembrane); JM – примембранный (juxtamembrane), APPjmtm – фрагмент APP686-726; ДФХ – додецилфосфохолин; ДСК – доксилстеариновая кислота; ЯЭО (NOE) – ядерный эффект Оверхаузера (nuclear Overhauser effect); NOESY – ЯМР-спектроскопия ЯЭО; HSQC – гетероядерная одноквантовая корреляция.

A coupled cell-free expression system (CECF) for the production of the transmembrane domain of the human receptor tyrosine kinase ErbB3 (residues from 632 to 675) has been developed based on the Escherichia coli S30 extract. The synthesis of the domain in the soluble form in the presence of various detergents and in the form of an insoluble precipitate of the reaction mixture has been examined. The conditions for the purification of the recombinant domain obtained using the two approaches have been determined. The final yield of the target protein under optimal conditions was 1.8–2.0 mg per 1 ml of the reaction mixture.

More than half of the mutations of the amyloid precursor protein (APP) discovered in familiar forms of Alzheimer’s disease are located in the transmembrane domain. The pathogenic mutations presumably affect the lateral dimerization of the APP transmembrane domain in the membrane and change the dimer conformation and/or stability. Thus, the mutations cause an alternative APP digestion pattern in the membrane and neurotoxic amyloid β-peptide generation. For the detailed study of the specific protein-protein and protein-lipid interactions of the APP transmembrane domain, an E. coli recombinant expression construct was made. The recombinant protein contains an APP transmembrane domain (APPtm(686–726)) with adjacent extramembrane N and C ends. Here, we report the method of isotope-labeled APPtm expression and purification in quantities necessary for a heteronuclear NMR spectroscopy structure and dynamics study. On the basis of the 1H-15N-HSQC spectra, we developed APPtm(686–726) solubilization conditions in the membrane-emulated milieu detergent micelles and lipid bicelles.

Экспрессирован ген «слабого» токсина из яда кобры Naja kaouthia. «Слабый» токсин является специфичным ингибитором никотинового ацетилхолинового рецептора, однако механизмы взаимодействия подобных нейротоксинов с рецептором на данный момент остаются неизвестными. Для бактериальной продукции «слабого» токсина из яда кобры N. kaouthia опробованы системы, разработанные ранее для нейроток-сина II из яда кобры N. oxiana. Созданы конструкции для цитоплазматической продукции «слабого» токсина из яда кобры N. kaouthia в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином и для секреции с лидер-ным пептидом STII. Однако получить «слабый» токсин в миллиграммовых количествах удалось только в составе цитоплазматических телец включения. Опробованы различные подходы для ренатурации токсина и проведен поиск условий оптимизации выхода целевого белка в процессе ренатурации. Полученный белок охарактеризован методами масс-спектроскопии, КД- и ЯМР-спектроскопии. Эксперименты по конкурентному ингибированию связывания [1251]б-бунгаротоксина с мембранами электрического органа ската Torpedo californica, содержащими никотиновый ацетилхолиновый рецептор мышечного типа (б12Я1гд), показали наличие биологической активности рекомбинантного «слабого» токсина, близкой к активности природного токсина (IC50 4,3 ± 0,3 и 3,0 ± 0,5 мкМ соответственно). Взаимодействие рекомбинантного токсина с нейрональным никотиновым ацетилхолиновым рецептором человека а7 типа, трансфецированным в клеточной линии GH4C1, также показало наличие активности, близкой к таковой природного токсина (IC50 31 ± 5 и 14,8 ± 1,3 мкМ соответственно). Разработанная бактериальная система продукции «слабого» токсина из яда кобры N. kaouthia позволила получить 15N-меченный аналог «слабого» токсина.