Segmental endotoxin challenge with lipopolysaccharide (LPS) can be used as a pharmacodynamic model to safely induce a transient airway inflammation in the peripheral lung of healthy subjects and to test the anti-inflammatory efficacy of investigational new drugs. In contrast to whole lung LPS challenge only a fraction of the dose is required that can be precisely administered to a specific lung region and a vehicle challenged segment as an intra-subject control can be included. The aim of this study was to assess the intra- and inter-individual variability of the response to segmental LPS challenge for the appropriate design and power calculation of future clinical trials. Two cohorts with 10 subjects each underwent two segmental LPS challenges within five weeks. The inflammatory response was evaluated in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid at 6 (cohort 1) and 24 h (cohort 2) both in the LPS and in a vehicle challenged segment, as well as in plasma for up to 26 h post LPS challenge. While the cytokine response was more pronounced at 6 h, the influx of neutrophils and monocytes dominated at 24 h; e.g. neutrophils increased from a median (inter-quartile range, IQR) of 0.14 (0.16) and 0.09 (0.08)x10(4) cells/mL BAL fluid at baseline to 10.2 (17.1) and 19.3 (15.9)x10(4) cells/mL 24 h after the two separate challenges. The within-subject variability was higher than the between-subject variability for most of the markers. However, sample size estimations based on the variability of outcome variables found lower or equal numbers with cross-over designs compared to parallel group designs for cellular markers at 24 h and cytokine variables at 6 h. The segmental LPS challenge model was safe. Future study designs have to balance between burden to the study subjects (4 versus 2 bronchoscopies), variability (within-versus between-subject), and the desired outcome variable (cells versus chemo/cytokine).

Ziele: Quantifizierung pulmonaler Inflammation nach endobronchialer Allergenprovokation mittels Turbo-Inversion Recovery-Magnitude(TIRM) MRT. Methode: 11 Probanden mit allergischem Asthma bronchiale sowie 4 gesunde Kontrollpersonen wurden bronchoskopisch in den Segmenten 4/5 rechts und links mit Allergenen (2 Segmente Normaldosis, 1 Segment 1/10 Niedrigdosis) bzw. Kochsalz provoziert. Es wurden jeweils drei MRT-Untersuchungen vor 0h, 6h und 24h nach Provokation mit einer TIRM MRT Sequenz durchgeführt. An den verschiedenen Zeitpunkten wurde das inflammatorische Infiltrat in den jeweiligen Segmenten quantifiziert: 0 = normal, 1 = leichtes peribronchiales Infiltrat, 2 = kleines Infiltrat, 3 = mittelgroßes Infiltrat, 4 = großflächiges Infiltrat mit Pleuraerguss. Der MRT-TIRM Score Wert wurde mit der lokalen Konzentration bronchoskopisch gewonnener eosinophiler Zellen 24h nach Allergenprovokation verglichen. Statistik mittels Kruskal-Wallis-Test. Angaben als Median [25%;75%]. Ergebnis: In der gesamten Kohorte unterschieden sich die Eosinophilenzahlen in % mit unterschiedlichem TIRM-Score 24h nach endobronchialer Provokation signifikant (p<0,001): TIRM0=0,13% [0;0,5], TIRM1=4,75 [2,4;6,8], TIRM2=30,3% [24,8;41,8], TIRM3=42% [30,8;51,3], TIRM4=63,8% [24,4;80,5] eosinophile Zellen. In der Asthma-Gruppe zeigte sich ein signifikant unterschiedlicher 24h TIRM Score sowie % Eosinophilenzahlen in den mit Kochsalz, mit Niedrigdosis und mit Normaldosis provozierten Segmenten(p<0,001): Kochsalz (n=11): TIRM 0 [0;0], Eosinophile 0,25%[0;5], Niedrigdosis (n=10): TIRM 1,5 [1;2], Eosinophile12,4% [4,3;32,1], Normaldosis (n=22): TIRM 3 [2;3,3], Eosiniphile 35,5% [12,1;58,5]. In der Kontrollgruppe war im TIRM Score und bei den Eosinophilen in % an 24h kein signifikanter Unterschied zwischen den mit Kochsalz-, mit Niedrigdosis- und mit Normaldosis provozierten Segmenten vorhanden. Schlussfolgerung: Der MRT TIRM Score stellt ein vielversprechendes Tool zur nichtinvasiven Quantifizierung entzündlicher Veränderungen nach endobronchialer Provokation dar.

Einleitung: Die Provokation mit LPS kann als Modell zur Untersuchung von Entzündungsprozessen in den Atemwegen dienen. LPS in GMP-Qualität steht in Deutschland nur begrenzt zur Verfügung, daher war es das Ziel dieser Studie zu testen, ob sich durch eine niedrig dosierte LPS-Inhalation eine im induzierten Sputum messbare neutrophile Atemwegsentzündung induzieren lässt.

Einleitung: Durch Sputuminduktion lassen sich wenig invasiv Zellen aus den Atemwegen gewinnen. Um Sputum Makrophagen/Monozyten aus gut charakterisierten Patientengruppen für die präklinische in-vitroTestung neuer Substanzen heranzuziehen, werden für das Sputum geeignete Zellisolationsverfahren benötigt. In dieser Untersuchung haben wir mit dem neu entwickelten pluriBead-Verfahren® (Pluriselect) zunächst die Effizienz der Depletion von neutrophilen Granulozyten aus Sputum getestet.

Ziele: Entwicklung einer nicht invasiven Methode zur quantitativen Messung pulmonaler Inflammation nach endobronchialer Allergenprovokation mittels T1-mapping Magnetresonanztomographie (MRT). Methode: Sechs Probanden mit allergischem Asthma bronchiale wurden bronchoskopisch in den Segmenten 4/5 rechts und links mit Allergenen provoziert. Es wurden jeweils drei MRT-Untersuchungen (1,5T Avanto, Siemens) vor (0h), 6h und 24h nach Provokation mit einer Inversion Recovery SnapShot fast low-angle shot (FLASH) Sequenz durchgeführt und daraus T1-Karten berechnet. Das Volumen über einem bei T1=1320ms festgelegten Schwellenwert wurde -getrennt nach linker und rechter Lunge- mit der lokalen Konzentration bronchoskopisch gewonnener eosinophiler Granulozyten in der bronchoalveolären Lavage 24h nach Allergenprovokation verglichen. Statistische Auswertung mit Kruskal-Wallis bzw. Wilcoxon-Test sowie Spearman Korrelation. Ergebnis: Über den Beobachtungszeitraum unterschieden sich die mittels der T1-Karten bestimmten Volumina entzündeter Gebiete signifikant voneinander (p=0,01) und waren am Zeitpunkt 6h (Median 288,9 [208,3; 471,9]ml, p=0,007) und 24h (235,2 [137,7; 401,6]ml p=0,02) signifikant erhöht im Vergleich zum Zeitpunkt 0h (43,7 [31,5; 168,5]ml). Ebenso waren die Konzentrationen der Eosinophilen in den Allergen-provozierten Segmenten (13,5 [2,5; 28,1]*104/ml) nach 24h signifikant höher als zum Zeitpunkt 0h (0,009 [0,002; 0,014]*104/ml). Die Volumina der in der MRT T1-Messung nach 6h als entzündet identifizierten Bereiche in der rechten und linken Lunge korrelierten mit der jeweiligen segmentalen Eosinophilenkonzentration 24h nach Provokation (r=0,62, p=0,03). Eine örtliche Übereinstimmung der betroffenen Areale im MRT mit den provozierten Segmenten war vorhanden. Schlussfolgerung: T1-Karten der Lunge eignen sich zur Bestimmung von Stärke und Lokalisation inflammatorischer Veränderungen nach endobronchialer Provokation und stellen damit eine nicht invasive Methode zur Erfassung der pulmonalen Entzündung im zeitlichen Verlauf dar.

Ziele: Darstellung der systemischen hämodynamischen Reaktion bei Patienten mit Asthma bronchiale nach segmentaler Allergenprovokation mittels zeitlich hochaufgelöster Phasenkontrast-Magnetresonanztomographie (MRT). Methode: Fünf Patienten mit allergischem Asthma bronchiale wurden mittels MRT (1,5 T) vor (0h) sowie 6h und 24h nach segmentaler endobronchialer Allergenprovokation untersucht. Phasenkontrast-MRT Messungen wurden in der Aorta ascendens (AO) und im Truncus pulmonalis (TP) mit einer zeitlichen Auflösung von 10ms durchgeführt. Bestimmt wurden jeweils der maximale systolische Fluss, die maximale Flussbeschleunigung (mFb), das Akzelerationsvolumen, die Akzelerationszeit, die Distensibilität, das Schlagvolumen und das Herzminutenvolumen (HMV). Mittels Spirometrie wurden die FEV1, FEV1%Soll, die FVC und FEV1/FVC bestimmt. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Kruskal-Wallis und Wilcoxon-Test. Ergebnis: Im Beobachtungszeitraum zeigten folgende Parameter eine signifikante Veränderung nach Allergen-Instillation (p<0,05): max. syst. Fluss, mFb, FEV1, Herzfrequenz (HF) und HMV. Der max. syst. Fluss vor Provokation (AO Median 454ml/s; 100%; TP 408ml/s; 100%) stieg 6h nach Provokation in der AO (471ml/s; 107,23%) und im TP (446ml/s; 118%) signifikant an (p<0,01). Die mFb in der AO (5718ml/s2; 113,97%) und im TP (4301ml/s2; 131%) nach 6h zeigte ebenfalls eine signifikante Zunahme (p<0,05) im Vergleich zu den Werten bei 0h (AO 4764ml/s2; 100%; TP 3954ml/s2; 100%) (p<0,01). Der FEV1-Wert (0h 3,9l; 100%) nahm 6h nach Provokation signifikant ab (3,5l; 87%) (p<0,05). Die HF und das HMV erhöhten sich 6h nach Provokation. 24h nach Allergen-Instillation war kein signifikanter Unterschied im Vergleich zu 0h mehr messbar (p>0,05). Schlussfolgerung: Bei Patienten mit Asthma bronchiale kommt es 6h nach segmentaler Allergenprovokation zu Veränderungen der systemischen Hämodynamik, die mittels Phasenkontrast-MRT nachweisbar sind. Diese Veränderungen sind innerhalb von 24 Stunden reversibel.

Preclinical studies suggest that the endocannabinoid anandamide restrains allergic airway obstruction and inflammation. Therefore, we applied saline or allergens via bronchoscopy into different lung segments of patients with allergic asthma. Twenty-four hours later, anandamide concentrations in bronchoalveolar lavage fluids had increased more than fourfold. Anandamide concentrations correlated with severity of airway inflammation. These observations suggest that allergen exposure specifically activates the pulmonary endocannabinoid system (ECS) in patients with allergic asthma.

Prediction of lung innate immune responses is critical for developing new drugs. Well-established immune modulators like lipopolysaccharides (LPS) can elicit a wide range of immunological effects. They are involved in acute lung diseases such as infections or chronic airway diseases such as COPD. LPS has a strong adjuvant activity, but its pyrogenicity has precluded therapeutic use. The bacterial lipopeptide MALP-2 and its synthetic derivative BPPcysMPEG are better tolerated. We have compared the effects of LPS and BPPcysMPEG on the innate immune response in human precision-cut lung slices. Cytokine responses were quantified by ELISA, Luminex, and Meso Scale Discovery technology. The initial response to LPS and BPPcysMPEG was marked by coordinated and significant release of the mediators IL-1β, MIP-1β, and IL-10 in viable PCLS. Stimulation of lung tissue with BPPcysMPEG, however, induced a differential response. While LPS upregulated IFN-γ, BPPcysMPEG did not. This traces back to their signaling pathways via TLR4 and TLR2/6. The calculated exposure doses selected for LPS covered ranges occurring in clinical studies with human beings. Correlation of obtained data with data from human BAL fluid after segmental provocation with endotoxin showed highly comparable effects, resulting in a coefficient of correlation >0.9. Furthermore, we were interested in modulating the response to LPS. Using dexamethasone as an immunosuppressive drug for anti-inflammatory therapy, we found a significant reduction of GM-CSF, IL-1β, and IFN-γ. The PCLS-model offers the unique opportunity to test the efficacy and toxicity of biological agents intended for use by inhalation in a complex setting in humans.

Einleitung: In einer klinischen Studie, die den Einfluss von Endotoxin auf die allergische Entzündung beim Asthma bronchiale untersuchte, konnten wir zeigen, dass Endotoxin die allergische Entzündungsreaktion in der Lunge verstärkt. Ferner konnten wir zeigen, dass Endotoxin wie auch Allergen einen Einstrom von dendritischen Zellen in den Alveolarraum induzieren. Ziel dieser Studienerweiterung war es, die eingewanderten myeloischen und plasmazytoiden dendritischen Zellen (DC) auf ihre antigen-präsentierenden Eigenschaften zu untersuchen. Methodik: 24 Stunden nach segmentaler Instillation von Allergenextrakt (Dermatophages pteronyssinus) und einer Kombination aus Allergenextrakt und Endotoxin (Clinical Center Reference Endotoxin, NIH) wurden die durch eine bronchoalveolärer Lavage gewonnenen Zellen durch Verwendung eines 6-Farben Antikörper-Cocktails mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsorters (FACSAria™) isoliert. Myeloische DC wurden durch die Oberflächermarker-Kombination CD33/BDCA1(CD1c) identifiziert, plasmazytoide DC durch die Kombination von CD123/BDCA-2. Beide Subpopulationen wurden durch CD14dim/neg/CD16neg von Monozyten abgegrenzt. Die allogenen peripheren T-Lymphozyten wurden durch eine Negativ-Depletion mit magnetische Beads isoliert. Für die Co-Kulturen wurden 3×104 sortierte alveolare Monozyten, mDC und pDC mit 1×105 allogenen T-Lymphozyten für 5–7 Tage bei 37°C inkubiert. Ergebnisse: In der Co-Kultur mit autologen T- Lymphozyten zeigten die durch FACS isolierten alveolären myeloischen DC, nicht jedoch die plasmazytoiden DC eine Stimulation der T-Zellproliferation.

Hintergrund: Endotoxin ist eine ubiquitär vorkommende proinflammatorische Substanz, die als Bestanteil von Umweltstäuben und als Innenraumbelastung durch Tabakrauch von Bedeutung ist. Die Inhalation von Endotoxin führt bei Asthmatikern zur Verschlechterung der Atemfunktion. Rationale: Ziel dieser Studie war, die Modulation der allergischen Entzündung durch Endotoxin unter kontrollierten Expositionsbedingungen zu untersuchen. Methodik: Bei 15 Patienten mit leichtem Asthma wurde bronchoskopisch 2 ng/kg Endotoxin (LPS), Allergen (Dermatophagoides pteronyssinus) sowie deren Kombination jeweils segmental instilliert, und die zuvor provozierten Segmente nach 24h lavagiert. Die Identifikation/Differenzierung der Lavage-Zellen (Monozyten, dendritische Zellen (pDC, mDC)) erfolgte durchflusszytometrisch. Ergebnisse: Allergen, LPS und Allergen/LPS führten zu einer signifikanten Erhöhung der Gesamtzellzahl mit einem signifikanten Anstieg der Monozyten- und Eosinophilenzahl, wobei die Gesamtzellzahl durch Allergen/LPS gegenüber Allergen (p<0,001) und LPS (p<0,05) weiter gesteigert wurde. Allergen/LPS führte zum stärkeren Influx von Monozyten und Eosinophilen in Vergleich zum Allergen (p<0,05); gegenüber LPS allein war der Einstrom von Eosinophilen verstärkt (p<0,05). Allergen, LPS und Allergen/LPS induzierten einen Influx von mDC (p<0,001), der durch Allergen/LPS gegenüber Allergen weiter gesteigert wurde (p<0,001). Ein Einstrom von pDC konnte nur unter LPS (p<0,05) und Allergen/LPS (p<0,05) induziert werden. Allergen/LPS zeigte zu Allergen (p<0,05) und LPS (p<0,05) eine höhere Zahl von pDC. Schlussfolgerung: Endotoxin ist in der Lage, die allergische Entzündungsreaktionen zu verstärken. Sowohl Endotoxin als auch Allergen führen zu einem Einstrom von mDC in den Alveolarraum, deren Influx unter Allergen durch Endotoxin gesteigert wird. Der Einstrom von pDC wird durch Endotoxin jedoch nicht durch Allergen induziert; dieser wird aber durch die Kombination mit Allergen gesteigert.

Epidemiologic studies have shown an increased prevalence of allergic asthma in children living in a German smelter area (Hettstedt) compared with a cohort who live in a nonindustrialized area (Zerbst). However, it is not known whether ambient particles (particulate matter(2.5) [PM(2.5)]) from these areas induce distinct lung inflammation, which might be an explanation for this difference. Therefore, 100 microg of PM(2.5) suspensions, collected simultaneously in the two areas, were instilled through a bronchoscope into contralateral lung segments of 12 healthy volunteers. PM(2.5) from both Hettstedt and Zerbst increased the number of leukocytes in the bronchoalveolar lavage performed 24 hours later. PM(2.5) from Hettstedt, but not Zerbst, induced a significant influx of monocytes (Hettstedt: 7.0% vs. Zerbst: 4.3%) without influencing the expression of surface activation markers on monocytes and alveolar macrophages. Oxidant radical generation of bronchoalveolar lavage cells and cytokine concentration (interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha) in bronchoalveolar lavage fluid was significantly increased after instillation of Hettstedt PM(2.5). We conclude that environmentally relevant concentrations of PM(2.5) from the smelter area induced distinct airway inflammation in healthy subjects with a selective influx of monocytes and increased generation of oxidant radicals. The higher concentration of transition metals in PM(2.5) from Hettstedt might be responsible for this increased inflammation.

Methods for detecting regional gastrointestinal ischemia are rare. An early detection of ischemia in the stomach or ileum can be achieved by the continuous intramucosal Pco2 (Pico2) measurement in the region. However, physiological consideration suggests that the placement of a fiberoptic CO2 sensor in the peritoneal cavity should yield comparable results. We tested the hypothesis that a continuous Pco2 measurement in the peritoneal cavity allows the early detection of regional intestinal ischemia. A laparotomy was performed in six pigs (54.7 ± 3.7 kg) with a tourniquet being placed around respective vessels to allow complete ischemia of a 2.75-m part of the ileum. A fiberoptic CO2 sensor (Pico2-ileum) was placed intraluminally in the ileum outside this segment. A second fiberoptic CO2 sensor to measure intraperitoneal Pco2 (i.p.-Pco2) was placed inside the peritoneal cavity in close vicinity to the ischemic gut segment. Gastric Pico2 was determined by using air tonometry. After baseline measurements, ileal ischemia was induced for 180 min followed by a 30-min reperfusion period. Statistics were performed with a Friedman test followed by Wilcoxon Analysis with P < 0.01 considered significant. With the onset of local ileal ischemia, a sudden increase in i.p.-Pco2 from 48.9 (45.0–51.5) mm Hg (mean and 25–75 percentiles) to 94.3 (87.9–95.5;P < 0.01) mm Hg was observed. Gastric Pico2 (49.0 [47.5–51.0]/53.5 [49.0–54.0] mm Hg), and ileal Pico2 (56.4 [44.6–57.0]/54.3 [46.1–57.8] mm Hg) did not change. With reperfusion, the i.p.-Pco2 decreased but stayed above baseline values. Implications Unless systemic changes are induced, regional intestinal perfusion deficits cannot be detected with a Pco2 measurement in the gastric lumen. In pigs, an occlusion of blood flow to an isolated gut segment resulted in a significant increase in intraperitoneal CO2 tension. Thus, the measurement of intraperitoneal Pco2 could allow the early detection of regional intestinal ischemia.