OBJECTIVE:Dopamine agonists and somatostatin analogs are commonly used in prolactinomas and somatotropinomas. Response to these therapies is heterogeneous. Whether resistance is linked to specific tumor subtypes or to shared mechanisms of resistance is not known. The aim was to explore distinct molecular subtypes of prolactinomas and somatotropinomas and their association with response to treatment. METHODS:The transcriptome of 46 prolactinomas and 58 somatotropinomas was analyzed. Unsupervised classifications were generated and tested for association with histological and clinical data, including response to treatment. RESULTS:Four subtypes of prolactinomas were identified, with variable sensitivity to dopamine agonists (P < 10-4). Sensitive tumors accumulated in the subgroup with the highest DRD2 expression, while resistant tumors accumulated in the 3 remaining ones, enriched in genes related to cAMP metabolism, to mitochondrial and ribosomal activity, and to immunity, respectively. Sparsely granulated somatotropinomas (N = 16) presented a separated molecular entity, mixing tumors resistant and sensitive to somatostatin analogs. The remaining somatotropinomas were classified into 5 subtypes, with variable sensitivity to somatostatin analogs (P < 10-4). Sensitive tumors accumulated in 3 subgroups, characterized by GNAS somatic mutation, PIT1 and SF1 coexpression, and the stem-cell marker SOX2 expression, respectively. Resistant tumors accumulated in the 2 remaining ones, enriched in genes related to cell cycle and to mesenchymal differentiation, respectively. Somatostatin receptor 2 (SSTR2) expression was associated with response to somatostatin analogs in sparsely granulated somatotropinomas (P = .022), but not in other somatotropinomas (P = .923). CONCLUSIONS:Prolactinomas and somatotropinomas were classified into distinct transcriptomic groups. Resistance to medical therapies was linked to distinct tumor subtypes, suggesting distinct mechanisms of resistance.

Disclosure: P. Vaduva: None. F. Violon: None. A. Chansavang: None. D. Hadjadj: None. G. Raverot: None. S. Espiard: None. A. Attia: None. L. Bouys: None. L. Thomeret: None. A. Weber Kuhn: None. K. Perlemoine: None. N. Chevalier: None. M. Vantyghem: None. M. Polak: None. M.C. Fragoso: None. A.S. Berthon: None. B. Ragazzon: None. A. Jouinot: None. E. Pasmant: None. J.Y. Bertherat: None. Objective: Constitutional duplications of the PRKACA gene locus (encoding the catalytic subunit of the Protein Kinase A) have been described in rare cases of Cushing’s syndrome due to bilateral nodular adrenocortical diseases (BNAD). The pathological description according to the current WHO definition of adrenal tumors still needs to be reported. The objective here was to evaluate the results of the systematic screening of PRKACA constitutive duplication in BNAD and to specify the associated hormonal and pathological phenotype. Methods: Between 2020 and 2024, 781 index cases diagnosed with BNAD: bilateral macronodular adrenal disease (BMAD) (n=693) or primary pigmented nodular adrenocortical disease (PPNAD) (n=88) (14% of isolated PPNAD) were genotyped with a targeted Next Generation Sequencing (NGS) panel including the exonic and intronic flanking regions of the ARMC5, KDM1A, MEN1, PRKAR1A and PRKACA genes, or by whole genome sequencing. Familial screening was offered to relatives. In situ Hi-C libraries were generated from three patients’ tumors and chromatin conformation analysis were performed. Results: Constitutional duplications of PRKACA were identified in 8 index cases and 7/11 screened relatives (sex-ratio=1 male/2.5 female), supporting the involvement of the PRKACA oncogene through a constitutional copy gain mechanism. The whole genome sequencing performed on 4 index cases did not find any other gene involved in human pathology in the duplicated region, nor any other alteration in genes implicated in adrenal pathology. PRKACA tandem duplications generated neo-Topologically Associating Domains (TADs) (150kb), self-interacting genomic regions, in patient derived tumor Hi-C maps compared to Micro-C data from human embryonic stem cell line. All index cases and 6/7 relatives had PPNAD responsible for ACTH-independent hypercorticism, diagnosed at a median of 21 years old (range 9-35) and treated by bilateral adrenalectomy. The resected adrenals contained micronodules, composed mainly of large eosinophilic cells containing lipofuscin vacuoles, separated by patches of atrophic cortex, making the diagnosis of PPNAD. Similar staining was found with PRKACA and PRKAR1A antibody in these nodules and adjacent cortex, whereas in patients with PRKAR1A pathogenic variants, PRKAR1A staining was decreased in the nodule, compared to adjacent cortex. Conclusion: Constitutional duplication of PRKACA is causing PPNAD (9% of index cases with PPNAD in this cohort), but no other forms of BNAD. Immunohistochemistry may differentiate the genetic background of PPNAD (PRKAR1A pathogenic variants versus PRKACA duplications). PRKACA tandem duplications generated neo-TADs in patient derived tumor Hi-C maps, pointing to specific regions of gene expression dysregulation induced by PRKACA duplication in BNAD. Presentation: Sunday, July 13, 2025

OBJECTIVE:Constitutional duplications of PRKACA (PRKACAdup) have been described in rare cases of bilateral nodular adrenocortical disease (BNAD). The aim here was to clarify the phenotype in case of PRKACAdup, through systematic screening in BNAD patients, and study the molecular mechanisms involved. METHODS:Between 2020 and 2024, 781 index cases (IC) with BNAD (693 bilateral macronodular hyperplasia and 88 primary pigmented nodular adrenocortical diseases [PPNAD]) were genotyped using next-generation sequencing with a panel targeting ARMC5, KDM1A, MEN1, PRKAR1A, PRKACA, or whole-genome sequencing (WGS). Chromatin conformation analyses were performed with Hi-C libraries generated from 3 tumors. RESULTS:PRKACAdup was identified in 8/781 IC and 8/12 screened relatives. WGS performed on 4 IC presenting with PPNAD revealed no other genetic alterations in genes associated with human pathology within the duplicated region, nor any other alterations related to adrenal pathology. All IC with PRKACAdup underwent adrenalectomy for ACTH-independent hypercortisolism, with pathology confirming PPNAD. Other manifestations of Carney complex were observed in 8 of the 16 patients with PRKACAdup, limited to lentiginosis and benign tumors of the gonads. Immunohistochemistry using PRKACA/PRKAR1A antibodies facilitated the differentiation of the responsible genetic alteration. PRKACAdup was found to generate topologically associated neo-domains, in tumor Hi-C maps, as compared to controls. CONCLUSIONS:PRKACAdup causes PPNAD but no other forms of BNAD, so these should be sought in the absence of pathogenic PRKAR1A variants.

Adrenocortical carcinomas (ACC) are aggressive and resistant to medical treatment. This study reports a single-nucleus transcriptome atlas of steroid and microenvironment cells in 38 human normal adrenals and adrenocortical tumors. We identify intermediate-state cells between glomerulosa and fasciculata, a transition state in the centripetal trans-differentiation of normal steroid cells. In tumors, steroid cells show expression programs reflecting this zonation. Although ACC microenvironment is scarce, its signatures combine with those of steroid cells into ecotypes. A first ecotype combines cancer-associated fibroblasts, tumor-associated endothelial cells, with hypoxia and mitosis signatures in steroid cells. Another ecotype combines exhausted T cells, with fasciculata steroid signature. These ecotypes are associated with poor survival. Conversely, a third ecotype combines inflammatory macrophages, with reticularis steroid signature, and better outcome. These steroid/microenvironment cells interplays improve outcome predictions and may open therapeutic options in aggressive ACC, through immune microenvironment activation by modulating glucocorticoids/androgens balance.

BackgroundPrimary Bilateral Macronodular Adrenal Hyperplasia (PBMAH) is a rare cause of Cushing's syndrome due to bilateral adrenocortical macronodules. Germline inactivating variants of the tumor suppressor gene ARMC5 are responsible for 20-25% of apparently sporadic PBMAH cases and 80% of familial presentations. ARMC5 screening is now routinely performed for PBMAH patients and families. Based on literature review and own observation, this study aims to give an overview of both published and unpublished ARMC5 genetic alterations and to compile the available evidence to discriminate pathogenic from benign variants.Results146 different germline variants (110 previously published and 36 novel) are identified, including 46% missense substitutions, 45% truncating variants, 3% affecting splice sites, 4% in-frame variants and 2% large deletions. In addition to the germline events, somatic 16p loss-of-heterozygosity and 104 different somatic events are described. The pathogenicity of ARMC5 variants is established on the basis of their frequency in the general population, in silico predictions, familial segregation and tumor DNA sequencing.ConclusionsThis is the first extensive review of ARMC5 pathogenic variants. It shows that they are spread on the whole coding sequence. This is a valuable resource for genetic investigations of PBMAH and will help the interpretation of new missense substitutions that are continuously identified.

INTRODUCTION:ARMC5 is the most prevalent gene predisposing to Primary Bilateral Macronodular Adrenal Hyperplasia (PBMAH), but germline KDM1A variants have been identified in the rare PBMAH associated with food-dependent Cushing's syndrome (FDCS). The purpose of this work was to assess the frequency of KDM1A variants in a large series of PBMAH patients. METHODS:301 consecutive PBMAH index cases from 8 international Endocrinology departments were included. Clinical, biological and imaging data were collected retrospectively. RESULTS:10 (3.3%) patients carried a germline KDM1A pathogenic or likely pathogenic variant, 60 (19.9%) carried a germline ARMC5 alteration, 231 (76.8%) had no identified genetic predisposition. FDCS was present in all patients with KDM1A variants and absent in the 2 other groups. KDM1A patients had a higher 24h urinary free cortisol (3.0-fold ULN vs 1.36 for ARMC5 patients and 0.66 for wild-type patients, respectively, p=0.0001). In accordance with FDCS pathophysiology, patients with KDM1A variants had a lower morning fasting plasma cortisol (192 nmol/L vs 407 and 428, respectively, p=0.0003) and a higher midnight plasma cortisol (487 nmol/L vs 297 and 171.96, respectively, p=0.0004). Morning/midnight plasma cortisol ratio below 0.65 holds 100% sensitivity and specificity for the detection of FDCS. All patients with KDM1A variants were women, vs 65% of ARMC5 patients and 67% of wild-type patients (p=0.0337). CONCLUSION:KDM1A germline pathogenic variants are rare in PBMAH and account for less than 5% of index cases. KDM1A seems constantly associated with FDCS, which can be evoked in front of a morning/midnight plasma cortisol ratio below 0.65.

OBJECTIVE:Adrenocortical tumor (ACT) morbidity is associated with steroid secretion, depending on tumor type. Indeed, adrenal steroidogenesis is a finely regulated process, altered in ACT. These alterations are usually characterized by blood steroid assays, also depending on steroid gonadal production and metabolism. Our aim was to determine steroid content directly in ACT tissues and to compare it with clinical diagnosis of steroid excess. METHODS:A profile of 13 steroids was analyzed in ultra-high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (Thermo Fisher Scientific®) in frozen tissue samples from 75 ACT, 7 Cushing's disease, and 9 normal adrenals. RESULTS:Steroid levels were 10-1000 times higher in tissue from normal adrenal than normal concentrations expected in blood. Concentration ratios between tissue from normal adrenal and blood reference values were lower for distal products than for steroid precursors. In adrenocortical cancers, intra-tissular steroid content was lower than in unilateral benign tumors despite clear clinical steroid excess. Unexpectedly, in overt-Cushing adenomas, intra-tissular cortisol levels were not higher and androstenedione levels were not lower than in non-functioning adenomas. Adrenal differentiation score based on transcriptome was well correlated with intra-tissular cortisol levels. CONCLUSION:Discrepancies observed between steroid levels measured in ACT tissue and clinical diagnosis of steroid excess suggest a dysregulation of steroid export depending on tumor type, opening new perspectives for diagnosis and treatment of steroid excess.

Searchable abstracts of presentations at key conferences in endocrinology ISSN 1470-3947 (print) | ISSN 1479-6848 (online)

Objectif Le gène ARMC5 est fréquemment altéré dans l’hyperplasie macronodulaire bilatérale des surrénales (HMBS) responsable d’un hypercortisolisme. Il a été montré qu’ARMC5 joue le rôle d’adaptateur de la Cullin3 pour l’ubiquitination et la dégradation de substrats spécifiques. Cependant, ARMC5 semble avoir d’autres rôles et pour essayer de les déterminer, nous avons identifié d’autres partenaires potentiels d’ARMC5 par spectrométrie de masse après marquage de proximité en utilisant la peroxydase APEX2 fusionnée à ARMC5. L’enzyme APEX2 permet de biotinyler les protéines à proximité dans les cellules vivantes. Matériels et méthodes Les protéines biotinylées par ARMC5-APEX2 ont été isolées puis identifiées par spectrométrie de masse. Des expériences de co-immunoprécipitation, d’immunofluorescence et de qPCR ont été réalisées après transfection de CACUL1-HA, ARMC5-flag (WT, mutants, fragments) ou de siRNA dans les cellules H295R, HEK293 et HeLa. Résultats Le marquage de proximité (ARMC5-APEX2) a mis en évidence une interaction de ARMC5 avec CACUL1 (CDK2-associated and Cullin domain containing protein-1). Cette interaction est confirmée par co-immunoprécipitation et nécessite le domaine BTB d’ARMC5. CACUL1 ne semble pas être ubiquitiné par CUL3/ARMC5. La surexpression de CACUL1 conduit à une translocation nucléaire de ARMC5 qui est normalement majoritairement cytoplasmique. Enfin, l’invalidation de CACUL1 conduit à une augmentation de l’expression des gènes de la stéroïdogenèse. Discussion L’ensemble de ces données montre qu’ARMC5 et CACUL1 forment un complexe dont le rôle exact au niveau nucléaire et en particulier sur la stéroïdogenèse reste encore à définir.

Objectif L’altération moléculaire la plus fréquente dans les tumeurs cortico-surrénaliennes (TCS) est l’activation de la voie Wnt/β-caténine, causée dans un tiers des cas par une mutation activatrice (p.S45P) de la β-caténine inhibant sa dégradation protéosomale. L’E3-ubiquitine ligase SIAH-1 dégrade la β-caténine mutée dans des cellules intestinales. Notre objectif est donc de déterminer si favoriser l’activité de SIAH1 pourrait limiter l’activation de cette voie dans les TCS. Matériel et méthodes Des immunoprécipitations ont été réalisées dans les lignées cortico-surrénaliennes humaines, NCI-H295R. L’activité transcriptionnelle de la β-caténine a été mesurée après transfection du rapporteur TOPFlash dans les H295R mutées pour la β-caténine. Résultats Nous avons démontré que SIAH1 interagit avec la β-caténine même mutée (p.S45) et induit une augmentation de son ubiquitination dans les cellules H295R. De manière intéressante, cela résulte en une diminution de la demi-vie (25 %) et de l’activité transcriptionnelle de la β-caténine (50 %) dans les H295R qui sont constitutivement activées. Discussion Nos résultats démontrent donc que SIAH1 induit une dégradation de la β-caténine ce qui, en cascade, réduit son activité transcriptionnelle dans des cellules cortico-surrénaliennes mutées pour la β-caténine. L’activité de SIAH1 pourrait donc participer à la régulation fine de l’activation de cette voie pro-oncogénique qui est essentielle pour la différenciation normale du cortex surrénalien. Nous analysons donc maintenant les conséquences de la perte d’une des deux isoformes murines de SIAH1, Siah1a sur la régulation de la voie Wnt/β-caténine et sur la différenciation du cortex surrénalien in vivo.

Objectif Le pronostic des corticosurrénalomes est hétérogène. La classification transcriptomique sépare les adénomes (cluster « C2 ») des corticosurrénalomes et en identifie deux clusters, « C1A » et « C1B » de pronostic différent. Le RNA-seq3′ permet de déterminer le transcriptome sur tissus fixés et inclus en paraffine, même sur des ARN très dégradés, mais au prix de données manquantes sur 10 à 50 % des transcrits. Notre objectif est de tester un algorithme de réseau de neurones pour prédire la classe moléculaire en routine. Patients et méthodes Nous avons entraîné différents modèles de machine-learning (réseau de neurones auto-encodeur, arbres d’isolation et forêt aléatoire, ACCacia) sur 88 tumeurs corticosurrénaliennes (28 C1A, 28 C1B, 32 adénomes). ACCacia comprend un module de prédiction, pour reconnaître C1A/C1B/C2 avec différents niveaux de données manquantes, et deux modules de détection d’anomalies afin d’identifier les situations d’inapplicabilité (i.e. tumeurs non surrénaliennes). Les performances ont été évaluées par validation croisée multiple. Les deux modules de détection d’anomalies ont été testés sur une cohorte additionnelle de 28 tumeurs hypophysaires. Résultats Le module prédicteur ACCacia maintient une précision de plus de 99 % jusqu’à 50 % de données manquantes. Ses modules de détection d’anomalie discriminent parfaitement la cohorte de tumeurs hypophysaires (AUC ROC=1). Deux cohortes de validation – rétrospective (n=207) et prospective (n>15) – sont en cours de constitution et permettront de préciser la valeur diagnostique et pronostique de cet outil. Conclusions ACCacia permet de prédire la classe moléculaire des tumeurs corticosurrénaliennes de façon robuste et spécifique à partir de données transcriptome paraffine.

Searchable abstracts of presentations at key conferences in endocrinology ISSN 1470-3947 (print) | ISSN 1479-6848 (online)

Objectif Les lésions corticosurrénaliennes bilatérales primitives (hyperplasies macronodulaires (PBMAH) et dysplasies micro-nodulaires pigmentées (PPNAD)) et secondaires à une maladie de Cushing (MC) sont responsables d’une sécrétion de stéroïdes d’intensité variable, objectivée par les dosages sanguins ou urinaires. Les variants pathogènes du gène ARMC5 identifiés dans certaines PBMAH sont associés à un phénotype clinicoradiologique plus sévère. Notre travail a pour objectif de caractériser plus finement les altérations de la stéroïdogenèse dans ces lésions par la mesure directe des stéroïdes dans le tissu corticosurrénalien. Matériel et méthodes Les concentrations intra-tissulaires de 13 stéroïdes (4 glucocorticoïdes, 2 minéralocorticoïdes, 5 androgènes, 2 précurseurs) ont été déterminées en LC-MS/MS, dans 38 échantillons issus de pièces de surrénalectomie (6 PBMAH ARMC5-sauvage, 7 PBMAH ARMC5-muté, 9 PPNAD, 7 surrénales de MC, 9 surrénales normales (SN)). Résultats Les MC présentaient des concentrations intra-tissulaires de glucocorticoïdes et d’androgènes plus élevées que les SN, concordantes avec les taux circulants. Les concentrations intra-tissulaires de stéroïdes étaient globalement plus basses dans les PBMAH ARMC5-muté que dans les PBMAH ARMC5-sauvage (cortisol : médiane [IQR]=5976 [3201–16741] vs 26971 [18069–44509] nmol/kg, p=0,02). La testostérone intra-tissulaire était élevée (entre 256 et 595 nmol/kg vs 40,3 [15,6–99,7] nmol/kg dans les SN) dans 4/9 PPNAD, (2F/2M). Discussion Nos résultats confortent l’hypothèse d’une stéroïdogenèse inefficace en cas d’inactivation du gène ARMC5 dans les PBMAH. Les taux élevés de testostérone intra-tissulaire mesurés dans certaines PPNAD, non retrouvés au niveau circulant, interrogent sur la régulation de l’export des stéroïdes.

Searchable abstracts of presentations at key conferences in endocrinology ISSN 1470-3947 (print) | ISSN 1479-6848 (online)

Objectif La classification transcriptome sépare les tumeurs bénignes (cluster « C2 ») des corticosurrénalomes et identifie deux groupes de corticosurrénalomes, « C1A » (signature stéroïde et prolifération), de mauvais pronostic, et « C1B » (signature immune), de pronostic bien meilleur. Ces signatures étant définies à l’échelle du tissu (« bulk »), la composition et le rôle du microenvironnement tumoral restent peu connus. L’objectif de cette étude est de réaliser l’atlas cellulaire des corticosurrénalomes. Patients et méthodes Nous avons construit un atlas cellulaire à partir du transcriptome (10×) des noyaux de ∼ 170 000 cellules de surrénales normales (n=4), tumeurs bénignes (n=14) et corticosurrénalomes (n=20). Nous avons ensuite estimé la proportion des différents types cellulaires (Cibersortx) dans des données de transcriptome « bulk » de 201 corticosurrénalomes, afin de définir des « écotypes » tumoraux par clustering consensus et tester leur association avec la survie. Résultats Nous identifions trois écotypes tumoraux associés à la survie. Un premier écotype combine une signature de cellules endothéliales associées aux tumeurs (TEC) avec des signatures d’hypoxie et de mitoses dans les cellules stéroïdes. Un deuxième écotype combine une signature d’épuisement des lymphocytes T, avec une signature stéroïde fasciculée. Ces écotypes sont associés à « C1A » (p<10−15) et à un mauvais pronostic (log-rank p<10−9). Un troisième écotype combine une signature de macrophages inflammatoires « M1-like » avec une signature stéroïde réticulée et est associé à « C1B » et à un meilleur pronostic (log-rank p<10−7). Discussion Les signatures des cellules stéroïdes et du microenvironnement s’agrègent en écotypes tumoraux pronostiques, et confirment la partition C1A/C1B des corticosurrénalomes.

Searchable abstracts of presentations at key conferences in endocrinology ISSN 1470-3947 (print) | ISSN 1479-6848 (online)

Objective: Cushing's syndrome is characterized by high morbidity and mortality with high interindividual variability. Easily measurable biomarkers, in addition to the hormone assays currently used for diagnosis, could reflect the individual biological impact of glucocorticoids. The aim of this study is to identify such biomarkers through the analysis of whole blood transcriptome. Design: Whole blood transcriptome was evaluated in 57 samples from patients with overt Cushing's syndrome, mild Cushing's syndrome, eucortisolism, and adrenal insufficiency. Samples were randomly split into a training cohort to set up a Cushing's transcriptomic signature and a validation cohort to assess this signature. Methods: Total RNA was obtained from whole blood samples and sequenced on a NovaSeq 6000 System (Illumina). Both unsupervised (principal component analysis) and supervised (Limma) methods were used to explore the transcriptome profile. Ridge regression was used to build a Cushing's transcriptome predictor. Results: The transcriptomic profile discriminated samples with overt Cushing's syndrome. Genes mostly associated with overt Cushing's syndrome were enriched in pathways related to immunity, particularly neutrophil activation. A prediction model of 1500 genes built on the training cohort demonstrated its discriminating value in the validation cohort (accuracy .82) and remained significant in a multivariate model including the neutrophil proportion (P = .002). Expression of FKBP5, a single gene both overexpressed in Cushing's syndrome and implied in the glucocorticoid receptor signaling, could also predict Cushing's syndrome (accuracy .76). Conclusions: Whole blood transcriptome reflects the circulating levels of glucocorticoids. FKBP5 expression could be a nonhormonal marker of Cushing's syndrome.