无菌采集病死驼羔的肺脏、肠等组织进行微生物学诊断,对分离菌进行革兰氏染色镜检、小鼠致病性试验和16S rDNA基因鉴定确定为大肠杆菌.然后进行药敏试验,结果显示该分离大肠杆菌对替米考星、头孢曲松钠、氟苯尼考敏感.

新疆某羊场的绵羊出现发热咳嗽、精神萎靡、食欲减退、嗜睡和呼吸困难等症状.经剖检和细菌分离鉴定、PCR鉴定、药敏实验和小鼠致病性试验等方法,分离到了3株革兰氏阴性球杆菌,根据形状和大小判断疑似多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌;PCR鉴定方法有效扩增出1100 bp、875 bp和900 bp,3条目的条带,经测序与GenBank数据库中同源序列比对,3株菌分别为多杀性巴氏杆菌A型、F型和溶血性曼氏杆菌A2型;药敏试验显示,3株细菌的混合液对左旋氧氟沙星、乳酸环丙沙星敏感;小鼠致病性试验中,小鼠在18 h内陆续死亡,表明巴氏杆菌和曼氏杆菌毒力强.诊断结果为羊巴氏杆菌及曼氏杆菌感染的诊断和治疗提供参考.

本文首先调查病牛的感染情况和发病症状,然后解剖死亡牛只,最后采集病牛肺脏组织进行细菌分离和PCR鉴定.结果发现,死亡牛只的胸膜与心包膜发生粘连,肺切面呈大理石样,是胸膜肺炎的典型特征.此外,牛支原体和多杀性巴氏杆菌PCR检测结果均为阳性.由此得出结论:该次疾病是牛支原体以及荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌引起的混合感染.

为查明新疆喀什地区某牛场发生犊牛腹泻的原因,采集了8头病死犊牛及2头健康犊牛的粪便进行病原学诊断.对采集到的粪便采用细菌分离培养鉴定、药物敏感性试验,并对引起犊牛腹泻的常见病毒开展RT-PCR检测.结果显示分离出的致病菌为革兰氏阴性杆菌,经过16SrDNA测序表明该菌为致病性大肠埃希氏杆菌,其阳性率100％.药物敏感性试验显示,该致病菌对美罗培南、阿米卡星、阿奇霉素3种抗生素敏感,对其它10种抗生素耐药.牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)RT-PCR检测阳性率为75％,牛病毒性腹泻/粘膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)、牛轮状病毒(Bovine Rotaviruses,BRV)均为阴性.结论为该牛场犊牛腹泻主要由牛冠状病毒和致病性大肠埃希氏杆菌混合感染引起.

为了明确哈密某牛场犊牛死亡的病因,对菌株进行了分离纯化、革兰氏染色镜检、16S rDNA测序鉴定、小鼠致病性试验、药敏试验检测.结果表明,该分离菌为肺炎克雷伯氏菌,对小鼠致病性强.该分离菌株对硫酸阿米卡星、左氧氟沙星敏感;对阿奇霉素、头孢曲松钠、替米考星注射液和乳酸环丙沙星中度敏感;对氟苯尼考、头孢拉定、盐酸林可霉素、克林霉素、硫酸庆大霉素耐药.

[目的]构建多拷贝整合表达禽流感病毒样颗粒的重组巴斯德毕赤酵母,为H5 N1亚型禽流感基因工程疫苗提供基础.[方法]以巴斯德毕赤酵母GS115株18S rRNA基因(rDNA)部分序列,插入pPIC9K载体上XbaⅠ和Bsp1407Ⅰ位点间,构建多拷贝整合表达质粒p8K.再以禽流感病毒H5N1毒株基因组RNA为模板,RT-PCR扩增HA、M和NA基因,分别插入多拷贝载体p8K,构建表达质粒p8K-HA/M/NA.表达质粒分别扩增后线性化,按比例混合,电转化GS115感受态细胞.增菌后,经遗传霉素G418抗性平板筛选、PCR鉴定携带HA、M和NA基因序列的多拷贝整合菌株.阳性菌株增菌、诱导表达、高压均质破碎后,Western-blot检测表达产物.[结果]PCR鉴定阳性的重组菌株,其细胞裂解蛋白,免疫印迹试验可检测到与HA、M1和NA分子量一致的蛋白条带;电子显微镜可观察到大小约为80～120 nm的病毒样颗粒,免疫鸡能产生抗禽流感病毒中和抗体.[结论]重组毕赤酵母能够多拷贝整合、表达、组装禽流感病毒样颗粒.

为了解新疆野生北山羊小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)的分子特征,根据GenBank公布的PPRV基因组序列设计并合成引物,采用RT-PCR方法和基因测序技术获得病毒全基因序列,应用分子生物学分析软件,对分离的PPRV毒株进行序列分析.结果显示,本次分离的PPRV毒株(China/XJAKS/2017)属于基因IV型,基因组全长15954 nt,编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白;在系统进化上,与国内新疆分离株China/XJBZ/2015、China/XJYL/2013同源率分别高达99.0％、99.6％,与国外的巴基斯坦和塔吉克斯坦分离株亲缘关系最近.结果表明,PPRV已经在家养动物与野生动物之间传播.结果提示,PPRV传入野生动物群为我国消除PPR带来极大困难,需加强我国边疆地区PPR免疫隔离带建设,并对野生动物PPRV分子流行病学特点进行追踪监测.

为了制备针对小反刍兽疫病毒(Peste des peties ruminants virus,PPRV)F基因的核酸疫苗,并评价其对小鼠的免疫效果,试验采用DNA重组技术将F基因、优化密码子后的F基因以及连接乙型脑炎病毒信号肽(JEVSP)的优化密码子后的F基因3个目的片段分别克隆到真核表达载体pcD?NA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1(+)-F、pcDNA3.1(+)-F-opt和pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt,大量培养重组质粒菌后,以碱裂解法将菌体悬浮裂解,经中空纤维切向流超滤和微滤浓缩处理,将制备的核酸疫苗以100μg/只的剂量给Balb/c小鼠肌肉注射免疫,共分为4组,pcDNA3.1(+)-F组、pcDNA3.1(+)-F-opt组、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt组和pcDNA3.1(+)空载体组,每隔14 d免疫1次,共免疫3次,每次免疫14 d后利用中和试验检测抗体水平.结果表明:成功制备核酸疫苗pcD?NA3.1(+)-F、pcDNA3.1(+)-F-opt和pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt,免疫Balb/c小鼠14 d后pcD?NA3.1(+)空载体免疫组中和抗体阳性率为0,pcDNA3.1(+)-F组、pcDNA3.1(+)-F-opt组、pcD?NA3.1(+)-JEVSP-F-opt组抗体转阳性,且pcDNA3.1(+)-F-opt组、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt组抗体水平呈逐渐增加的趋势.说明成功制备小反刍兽疫核酸疫苗,并且能在小鼠上产生抗体.

为明确从新疆某绵羊养殖场送检的病死羊的致病菌,对病死羊的心脏、肝和肺组织采用细菌分离培养、形态观察、生化试验,纯化菌落进行种特异性和荚膜血清型PCR鉴定以及药敏试验、致病性试验和动物回归试验.为了解分离菌株的生物学特性及免疫原性,笔者以BALB/c小鼠为动物模型对分离株进行同源性和异源性的免疫攻毒保护试验.结果 显示,在BHI琼脂培养基上长出灰色、光滑小菌落,革兰氏染色为红色的小短杆菌;分离株能发酵葡萄糖等,符合多杀性巴氏杆菌(Pm)的生化特性;PCR扩增出大小为460bp的种特异性条带和1 045 bp的荚膜血清A型特异性条带,Blast检索结果与Pm的同源性为99.7％.结果 表明,分离菌为多杀性巴氏杆菌,属于荚膜血清A型.药敏试验显示,该菌株对头孢拉定、环丙沙星、替米考星等7种药物具有敏感性;该菌株能够引起实验小鼠和兔的发病死亡,根据羔羊的发病情况和临床表现,本菌为强致病性菌株;将分离株培养物研制成不同佐剂的灭活疫苗探究其免疫效果,氢氧化铝佐剂灭活疫苗可以抵抗同源菌的攻击,保护率能够达到100％;对异源血清型Pm免疫攻毒保护效果差,对D型、F型和未知型的保护率分别为20％、20％、0.本研究成功分离出1株绵羊A型多杀性巴氏杆菌,对羊巴氏杆菌病的流行监测和防控具有重要意义.

为了找出新疆某羊场羔羊陆续发病死亡的原因,试验解剖送检的6只羔羊,对组织病料进行细菌分离培养、染色鉴定、16S rRNA PCR鉴定、测序比对分析,并用分离株进行动物致病性试验和药敏试验.结果 表明:病原菌在BHI琼脂培养基上生长情况良好,为灰色不透明小菌落和透明扁平菌落,革兰氏染色为阳性球菌.PCR扩增出的条带大小为1 470 bp,将病原菌16S rRNA序列提交至GenBank中,与金黄色葡萄球菌和粪链球菌核苷酸序列的同源性分别为99％和98％.分离得到的金黄色葡萄球菌对小鼠致病性强,10h内小鼠均死亡,小鼠对粪链球菌不敏感.分离得到的这2株菌对克林霉素都有耐药性;对硫酸庆大霉素、左氧氟沙星、替米考星和乳酸环丙沙星均有敏感性.说明此次羔羊发病是金黄色葡萄球菌与粪链球菌混合感染引起,交替使用4种敏感药物对该地区养殖场发病羊进行治疗与预防可取得一定效果.

犊牛腹泻是常由多种病原微生物引起的一种急性传染病,是危害犊牛健康的最大疾病之一.为了降低规模养殖场腹泻犊牛的发病率和死亡率,本文简要分析规模化养殖场犊牛腹泻的致病原因,并提出了防治措施,以期为犊牛腹泻的防治提供参考.

[目的]为探明一起牛运输热的病原及生物学特性,[方法]研究采集病死牛心血、肺脏,对其进行细菌分离、生化试验和PCR鉴定,并对分离株进行毒力基因检测、致病性研究.[结果]结果显示,该分离菌为革兰氏阴性菌,呈球状或短杆状、两端钝圆、两极浓染.生化试验结果显示,分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、木糖等碳水化合物,不发酵脲酶和吲哚,产生少量酸而不产气,符合溶血性曼氏杆菌的生化特性.PCR鉴定为荚膜血清A1型溶血性曼氏杆菌,并完成了毒力基因的检测.[结论]结果表明,引起该批牛运输热的病原为携带毒力基因的荚膜血清A1型溶血性曼氏杆菌,本研究结果为进一步研究溶血性曼氏杆菌的致病机制、防控措施等提供参考.

目的 探讨小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)N蛋白原核表达、条件优化及反应活性.方法 参照GenBank中PPRV (Nigeria/75/1)N基因序列,人工合成该基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-N,转化至BL21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析.在不同温度、时间、IPTG浓度条件下诱导表达N蛋白,确定最佳表达条件.结果 PPRV N蛋白(64.4 kD)成功表达,能被羊PPRV免疫血清所识别.N蛋白主要以包涵体存在,其最佳诱导条件:诱导温度28℃、IPTG终浓度2.0 mmol/L、诱导时间16 h.结论 原核表达的PPRVN蛋白具有良好的特异性和反应活性,为单克隆抗体的制备及快速诊断方法的建立提供了技术资料.

为查明新疆北疆部分地区绵羊弓形虫感染情况,在伊犁、阿勒泰和昌吉地区4个专业养殖场和7户散养户共采集12批次403份绵羊血清样品,采用间接ELISA和IHA方法进行弓形虫抗体监测.结果表明,403份样品中共检出14份阳性样品,阳性率为3.5％;伊犁、阿勒泰和昌吉地区阳性率分别为3％、2％和4.4％;E专业养殖场和G散养户阳性率最高,分别达到4.5％和5.5％;专业养殖场和散养户阳性率分别为3％和4.2％.报告如下.

In order to research the antibody change tendency of secondary immunization, the sheep were injected with live attenuated peste des petits ruminants(PPR) vaccine at the 21st day after primary immunization. The PPR antibody at the 21st day after primary immunization and at the 3rd, 7th, 14th, 21st day after secondary immunization were detected respectively. The results indicated that the PPR antibody at 21st day after primary immunization reached to 5.18±2.87 and the positive rate was 84％. The PPR antibody level from the 3rd day to the 21st day after secondary immunization increased and the average titer were 5. 65 ± 2. 56, 6. 95 ± 1. 82, 7. 28 ± 1.18, 8.12 ± 1. 31 respectively, positive rate was 90％, 100％, 100％, 100％ respectively. The PPR antibody positive rate at primary immunization group from 21days to 323days was 83％, PPR antibody positive rate reached to 100％ at the 7th day after secondary immunization and kept high level to the 21st day, which showed that secondary immunization could enhance the effect of vaccine, and increase the positive rate of immune antibodies.

To establish the infectious cDNA clone of foot-and-mouth disease virus(FMDV),the complete ge-nome of a strain belonging to OHM/02 was amplified by RT-PCR and cloned into vector pUC57 to con-struct FMDV recombinant plasmid.The recombinant plasmid was transfected into BHK-21 cells with the plasmid that expresses T7 RNA polymerase.The typical CPE caused by rescued FMDV was observed.The rescued FMDV,which has a deleted B am HⅠ site to differentiate contamination from parental FMDV,was successfully obtained.Fluorescent light was observed by the indirect immunofluorescence assay and FMDV particles were observed by the immune electron microscope compared its parental virus.This stable infec-tious clone is an important tool for study molecular pathogenesis of FMDV and development of novel vac-cine against FMDV.

[Objective] To amplify the 5'-end sequences of the FMDV genome.[Method]RNA frozen in liquid nitrogen of FMDV O/Akesu/58 CE39A strain was reverse-transcribed to cDNA, which was ampli-fied, cloned and sequenced for the 5'terminal sequences.[Result]With the cDNA1 and cDNA3 as templates, LA Taq DNA polymerase, EX Taq DNA polymerase, PrimeSTAR? HS DNA polymerase, and three pairs of primersⅠ,ⅡandⅢwere used to amplify the 5'end fragment, but failed. Only when LA Taq DNA polymer-ase were used as the amplification enzyme, the cDNA2 as the template, and two pairs of primers Ⅰ, Ⅱ the expected fragment of the FMDV 5'terminal fragment could be amplified. And the tested sequences length were 787 bp and 797 bp, homology analysis of nucleotide sequences were 86. 2％ and 86. 3％ between the deter-mined and reference sequences.[Conclusion]Compared with other methods, the conventioanl PCR method possesses the advantages of low cost and simple operation in spite of its low efficiency. In this experiment, 72 PCR was carried out, and the success rate was 6/72, which indicated that the amplification of FMDV 5'termi-nal sequences was difficult, and the inversion of the primers and amplification primers should be rationally de-signed . The experiment has provided an alternative for the research of reverse genetics of a lot of RNA viruses.

[目的]扩增口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)O/Akesu/58 CE39A株基因组3'末端序列,并对其核苷酸序列进行分析,为FMDV反向遗传学研究奠定基础.[方法]采用普通PCR法和3'RACE法扩增FMDV基因组3'末端序列,利用分子生物学软件对该序列进行分析.[结果]扩增了口蹄疫病毒基因组3'末端序列,3'UTR长98 nt,Poly(A)长度不同(19、23、24、25、27、29、43).3'UTR序列二级结构含有2个茎环结构,分别位于8101～8140和8146～8190 nt.O/Akesu/58 CE39A株3'UTR序列与参考毒株O/MAY/3/2014(GenBank登录号:KY322672)和O/IND26(54)/2014(GenBank登录号:KJ825807)的核苷酸序列同源性最高,均为89.8％.[结论]普通PCR法和3'RACE法均可扩增出3'末端序列.同一毒株的亚克隆,其Poly(A)长度与基因扩增时所用方法有关.不同毒株的Poly(A)长度不同,可能是毒株本身属性,也有可能是由扩增方法不同造成.Poly(A)要么扩增成功后其长度不同,要么扩增失败.失败的原因可能是3'末端结构复杂,难于扩增.

为验证以鼠抗猪IgG为基底,用辣根过氧化物酶标记猪瘟E2蛋白,建立的猪瘟抗体ELISA检测方法的可行性,对影响ELISA试验结果的主要条件进行优化.结果表明,鼠抗猪IgG最佳包被浓度为1μg/ml,酶标猪瘟E2蛋白最佳稀释度为1:500,最佳封闭液为1％BSA.建立的方法对猪蓝耳病阳性血清、 猪圆环病阳性血清、 猪亚洲1型口蹄疫阳性血清、 猪O型口蹄疫阳性血清均无交叉反应.通过对50份试验样本的检测,对比该方法与商品化IDEXX的猪瘟病毒抗体检测试剂盒的符合性,试验结果表明,该方法检测猪瘟抗体的相对敏感性为76.9％(30/39),相对特异性为90％(45/50).

为确保小反刍兽疫活疫苗在免疫接种时的效果.本试验模拟野外操作环境,在不同稀释液、不同温度和不同放置时间条件下,检测并比较小反刍兽疫活疫苗病毒含量.结果表明,以PBS、含1％冷水鱼明胶的生理盐水、生理盐水分别稀释疫苗,1％冷水鱼明胶的生理盐水更适合作为小反刍兽疫活疫苗的稀释液.疫苗以三种不同的稀释液稀释后,在4h内,25 ℃或37℃条件下,不会影响其效价.