玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus,MCMV)是全球玉米种植产业最重要的病害之一,其快速、精准检测和鉴定方法在检疫防控中至关重要.本文综述了现有的玉米褪绿斑驳病毒分子检测方法的研究进展,总结了基于变温扩增的RT-PCR、RT-qPCR和多重RT-PCR方法,基于等温扩增的RT-LAMP、RT-RPA和RT-RAA方法,以及CRISPR/Cas系统和高通量测序等检测方法的优缺点,可根据不同情况选择合适的方法进行玉米褪绿斑驳病毒检测.最后,展望了新型检测方法在玉米褪绿斑驳病毒检测中的应用和发展趋势.

为建立番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)TaqMan荧光定量RT-PCR方法,本研究针对ToBRFV RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)基因序列设计了 4组特异性引物和TaqMan探针,构建了标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度和实际样品的检测效率进行评估.结果显示,该方法特异性强,与番茄花叶病毒、番茄斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、辣椒轻斑驳病毒、烟草环斑病毒和凤果花叶病毒等9种病毒均无交叉反应.建立的标准曲线的R2为0.999,扩增效率为102.096％,检测灵敏度为10 fg/μL,与EPPO PM 7/146(1)推荐的CaTa28、CSP1325方法相当,是常规RT-PCR的100倍;采用该方法成功从60份番茄和辣椒叶片、种子样品中检出10份阳性样品.建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,适用于实际样品中ToBRFV的快速精准检测.

植食性寄生蜂白翅希托种子小蜂主要为害伞形科产籽香料作物的种子,其寄主种类多、分布地域广、为害周期长、侵染率高、为害隐蔽、鉴定难度大.结合检疫工作实践中的发现与相关研究报道,介绍了该蜂的分类地位、寄主、分布、鉴定特征、田间防治和检疫处理措施等,浅析其传入我国的风险,并提出预警建议.

随着集约化生产、养殖环境恶化,急性肝胰腺坏死病(AHPND)成为了当前制约对虾养殖效益的主要疾病之一.本试验以凡纳滨对虾不同生长时期的亲虾、虾苗、成虾作为研究对象,将对虾的肝胰腺进行初步富集后,采用荧光PCR和普通PCR的方法,检测样品中pirAVP和pirBVP毒素基因;对虾苗AHPND的病原进行分离鉴定、药敏试验和动物致病性试验.结果显示,在116份样品中检测到亲虾AHPND阳性3份,虾苗AHPND阳性7份,成虾AHPND阳性9份;从虾苗AHPND样品中分离纯化获得1株弧菌,经生化鉴定为副溶血性弧菌;16S rRNA系统发育树分析显示,该分离株与副溶血性弧菌聚为一类.药敏试验结果显示,该分离株对头孢西叮、头孢呋辛、复方新诺明等11种抗菌药敏感,对头孢噻吩耐药,对阿米卡星中介.动物致病性试验结果显示,健康凡纳滨对虾浸染1.8×108 CFU/mL浓度的副溶血性弧菌菌液后,24 h内全部死亡,对虾的肝胰腺小管上皮细胞出现萎缩、变性、坏死等特征.本试验进一步掌握目前粤西地区不同生长时期凡纳滨对虾中AHPND的流行病学数据和病原特征,为该地区乃至全国的对虾养殖业AHPND的预防和控制提供参考依据.

为了快速准确检测洋葱腐烂病菌(Burkholderia gladioli pv.alliicola,简称Bga),根据GenBank中Bga与相关种的序列差异设计特异引物BG5/BG7和探针Bga-P,建立了 Bga常规PCR和荧光PCR检测方法.测试结果表明,引物和探针对供试的11株Bga菌株表现为阳性反应,其他64株供试菌株和空白对照均为阴性.常规PCR和荧光PCR方法的检测灵敏度分别为24 pg和240 fg菌体DNA.美国、法国、意大利等国进境的80批次洋葱种子样品的检测结果显示,这两种方法的阳性检出率分别为7.5％和12.5％.选取阳性样品进行病菌分离,成功从2批次法国进境洋葱种子中分离到目的菌.本文建立的洋葱腐烂病菌PCR检测方法可为口岸检测部门提供更高效、灵敏和特异的检测手段.

为准确检测进境玉米可能携带的玉米矮花叶病毒(maize dwarf mosaic virus,MDMV),基于MDMV外壳蛋白(coat protein,CP)保守基因序列,筛选3对引物和2组探针,并优化退火温度,构建基于微滴数字 RT-PCR(droplet digital reverse transcription-polymerase chain reaction,ddRT-PCR)的MDMV精准检测方法.该方法可特异性检测MDMV,对MDMV CP阳性质粒样品的检测灵敏度可以达到1×103拷贝/μL,对69份进口玉米种子检测,检出5批次玉米种子携带MDMV,而荧光定量RT-qPCR仅检出4批次玉米种子,表明建立的ddRT-PCR相对于RT-qPCR有更高的灵敏度和可靠性,可用于玉米上MDMV的检测鉴定.

介绍了我国口岸进口木材中多次截获的松十二齿小蠹,对该虫的分类地位、分布、寄主、危害及成虫形态特征进行了描述.将获得的该虫COⅠ序列通过GenBank数据库比对分析,以及用邻接法(NJ)构建的系统发育树,建立了该虫的DNA条形码检测方法,以期为口岸一线的检测鉴定提供参考.

玉米ZeamaysL.是重要的粮饲兼用作物.重要检疫性病毒玉米矮花叶病毒maize dwarf mosaic virus(MDMV)一直威胁玉米生产,为预防外来有害生物入侵,本研究以玉米可能携带的MDMV为目标,根据MDMV外壳蛋白(coat protein,CP)保守基因序列,基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),设计了 3对RPA引物,筛选并优化了反应体系,建立了 MDMV的快速检测方法,最终的RPA反应体系中引物终浓度为0.4 μmol/L,反应温度为42℃,反应时间为20 min.该方法可特异性检测MDMV,对MDMV CP阳性质粒样品的检测灵敏度可以达到105拷贝/μL(≈369 fg/μL),高于RT-PCR的检测灵敏度.该方法具有快速准确等优点,可用于玉米种子或植株中携带MDMV的检测.

本研究旨在建立番茄和辣椒种子携带番茄褐色皱果病毒（Tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）快速、精准的核酸检测技术。选用ToBRFV的MP蛋白基因和CP蛋白基因保守序列作为靶标区域设计了1对特异性引物ToBRFV-F-5506/ToBRFV-R-6186，建立了ToBRFV的RT-PCR检测方法。用ToBRFV阳性样品对该方法的灵敏度和特异性进行了系统分析，最后以疑似ToBRFV感染的实际种子样品进行验证，并与已报道的9对ToBRFV特异性引物对实际种子样品的检测效率进行比较分析。结果表明，采用本研究建立的RT-PCR检测方法检测限值至2.5ng/μL，且与番茄和辣椒的其他主要病毒无交叉反应，特异性良好，对50份疑似ToBRFV感染的番茄和辣椒种子样品的阳性检出率高达40%，要优于已报道的9对ToBRFV特异性引物。本研究建立的番茄褐色皱果病毒RT-PCR检测方法具有较高的灵敏度和良好的特异性，适用于ToBRFV感染的番茄和辣椒种子样品检测。

根据番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)外壳蛋白(coat protein,CP)的保守基因序列设计l对特异性引物,建立了基于SYBR Green Ⅰ的ToBRFV实时荧光RT-PCR检测方法,并对其进行了特异性、灵敏度检测,对自然感染ToBRFV的番茄、辣椒种子进行了检测验证.结果 表明,构建的实时荧光RT-PCR检测ToBRFV阳性的番茄种子总RNA和重组质粒标准品的检测低限分别为0.2 ng/μL和50.0拷贝/μL,均为普通RT-PCR检测灵敏度的100倍;对番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)、番茄环斑病毒(tomato ringspot virus,ToRSV)、番茄黑环病毒(tomato black ring virus,TBRV)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)、辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMoV)、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)和烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus,TRSV)等7种病毒均无扩增反应,具有很好的特异性.对50份疑似感染了ToBRFV的番茄和辣椒种子样品检测结果表明,与常规RT-PCR和已报道的2种实时荧光RT-PCR方法相比,本研究建立的实时荧光RT-PCR方法具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点,适用于低丰度ToBRFV的种子检测.

为研究γ射线辐照后桔小实蝇体内酶活性变化,用160 Gy辐照桔小实蝇3龄期5日龄幼虫,然后在不同时段测定幼虫体内的酶活性,以观察其变化.结果表明:辐照主要对虫体内的酚氧化酶(PO)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)活性产生了影响,羧酸酯酶(CarE)、过氧化氢酶(CAT)活性变化不大,在正常和辐照后的桔小实蝇幼虫体内均未测出过氧化物酶(POD)活性.

马铃薯斑纹片病菌(Candidatus Liberibacter solanacearum)是一种主要为害伞形花科和茄科植物的重要有害生物,目前无法人工培养且可随种子远距离传播.准确灵敏的PCR检测方法对病害预警和防止扩散具有重要意义.本文通过复合引物法构建扩增内标(internal amplification control,IAC),建立了马铃薯斑纹片病菌含扩增内标的双重实时荧光PCR检测体系,有效指示了PCR检测过程中的假阴性现象.试验结果表明:双重与单重实时荧光PCR的检测灵敏度一致,当扩增内标添加量为3.4×10-5ng时,样品DNA的检测低限为0.4 ng.40个样品的检测结果显示,与单重实时荧光PCR相比,双重荧光PCR方法的阳性检出率由25.00％提高到27.50％,提高了检测结果的准确性.

利用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时荧光PCR技术相结合(PMA-qPCR),对PMA质量浓度、暗孵育和曝光时间等因素进行优化,建立了检测十字花科黑斑病菌活菌的方法.结果显示,当PMA质量浓度为10μg/mL,避光条件下孵育5min、然后曝光10min,此条件下能够抑制107CFU/mL十字花科黑斑病菌死菌的DNA扩增,对活菌扩增无影响;通过对比qPCR和PMA-qPCR的灵敏度可知,两者灵敏度差异不大,最低检出限均为103 CFU/mL;将PMA-qPCR方法用于实际5批十字花科黑斑病菌阳性的油菜籽样品检测,结果显示该方法能准确反映实际样品的带活菌的情况.本研究为十字花科黑斑病菌活菌的检测提供了快速检测方法,可为实验室该病菌的快速筛检提供参考.

利用6株玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii,PSS)和29株相关菌株对报道的18对检测引物/探针的特异性进行测试.试验结果显示,其中16对引物/探针会出现假阳性或弱假阳性扩增,仅引物cpsAB2313F/cpsR和DC283ga1E/DC283galEc可以特异检测目的菌;两对引物的检测灵敏度分别为0.1pg和1pg.根据测试结果,推荐这2对引物用于检测玉米细菌性枯萎病菌,优先推荐引物cpsAB2313F/cpsR.

云浮口岸从土耳其进境木质包装中截获多头活小蠹虫,本研究对该小蠹虫的形态特征进行描述,同时采用小蠹科通用引物CI-J-2183和TL2-N-3014进行PCR扩增该虫的COⅠ基因序列.结果获得758 bp的基因序列,通过与GenBank数据库比对分析显示,该序列与GenBank数据库上的3条欧洲纵坑切梢小蠹COⅠ序列相似性高达99％;采用邻接法(NJ)构建的系统发育树也显示该虫与欧洲纵坑切梢小蠹亲缘关系极近且在同一进化分支中.结合形态特征和DNA条形码序列分析,可最终判定所截获昆虫为欧洲纵坑切梢小蠹.

[Objective] The aim was to investigate the data of alien species carried by imported goods in Yunfu port in recent years.[Method] We analyzed the situation of plant quarantine and the data of invasive pests intercepted at Yunfu port during 2012-2016.[Result] A total of 139 species of exotic animals and plants were intercepted at Yunfu port during 2012-2016,including 85 species of insects (intercepting 195 times),39 species of plants (intercepting 119 times),1 species of mite (intercepting 5 times),2 species of nematodes (intercepting 10 times),5 species of snails (intercepting 12 times),6 species of spiders (intercepting 204 times) and 1 species of fungus (intercepting 2 times).Among them,Theba pisana Müller was firstly intercepted in China,Scolytus multistriatus and Emex spinosa were intercepted for the first time in Guangdong Province,and Solenopsis invicta,Heterobostrychus aequalis,Bactrocera dorsalis,Solanum torvum,Callosobruchus maculatus and Xanthium sp.were firstly intercepted in Yunfu port.These interception works of plant quarantine prevented effectively invasion and spread of alien pests at Yunfu port in recent years.In addition,the imported stones from India,Pakistan,Iran and Turkey etc.were higher risk with carrying alien pests because their packaging extensive and poor health conditions.According to above results,the measures for enhancing quarantine and inspection to imported stones were provided.[Conclusion] The results provide information for further establishing the biosafety control system in the entry-exit inspection and quarantine department.

The pest interception of imported stone in Yunfu port from 2013 to 2017 is analyzed in this article.The results show that 108 species (genus) of pests were intercepted with 659 times during this period,including 11 species (genus) of quarantine pests with 52 times.Solenopsis invicta and Callosobruchus analis were the most frequency and widest sourcing quarantine pests.Penicillium sp.,plant seed,Fruticicolidae and insects,including Formicidae,Carabidae,Gryllidae and Labiduridae,were the non-quarantine pests of higher frequency.The mainly sourcing countries of pests intercepted were Turkey,Pakistan,Iran,Portugal,India and Spain.According to the results of this study,some suggestions about imported stone quarantine were provided for reference.

2016年3月,云浮出入境检验检疫局新港检验检疫科在对装载有原产摩洛哥大理石荒料的进口集装箱查验时发现了多种有害生物.经广东出入境检验检疫局技术中心植检室专家鉴定,检出了刺亦模草、莎草、紫草、菊科、蔷薇科等12种杂草.其中刺亦模草是我国进境植物检疫性杂草,这是广东云浮口岸首次截获该种类,也是广东局首次截获.