目的 探讨淡豆豉异黄酮(isoflavones from semen sojae preparatum,ISSP)对人脐静脉内皮细胞融合细胞(human umbilical vein cell fusion cell,EA.hy926)氧化损伤的保护作用及其可能机制.方法 体外培养EA.hy926细胞,氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导形成氧化损伤细胞模型后随机分为空白组、模型组(ox-LDL)、雌二醇组(ox-LDL+ E2)、Nrf2激动剂组(ox-LDL+ tBHQ)、淡豆豉异黄酮组(ox-LDL+ ISSP).采用CCK-8法检测细胞生存率,二硝基苯肼显色法检测LDH活性,ELISA法检测ET-1水平,WST-1法检测SOD活力,TBA法检测MDA含量;通过STITCH数据库分析淡豆豉有效成分与Nrf2蛋白的相互作用关系;免疫荧光检测细胞内Nrf2蛋白荧光表达,Western Blot检测HO-1和核内Nrf2蛋白表达情况,qRT-PCR检测Nrf2和HO-1 mRNA表达情况.结果 与模型组相比,在ISSP干预下,细胞存活率升高,LDH活性、ET-1水平和MDA含量均降低,SOD活力升高(P＜0.01或P＜0.05);STITCH分析结果显示,异黄酮及其主要成份染料木素与Nrf2均有密切联系,可通过多种途径对Nrf2产生作用;正常状态下,Nrf2蛋白主要表达于细胞质中,ox-LDL单独或合并E2、ISSP、tBHQ干预后,细胞核内Nrf2蛋白荧光表达增多;与模型组相比,ISSP干预可显著增加细胞中Nrf2、HO-1的蛋白和mRNA表达(P＜0.01或P＜0.05).结论 淡豆豉异黄酮可以显著降低ox-LDL引起的EA.hy926细胞氧化损伤,其作用机制可能与细胞内Nrf2信号通路有关.

目的:研究仙茅多糖辅助流感裂解疫苗对小鼠抵抗流感病毒感染的免疫效应.方法:将健康昆明小鼠140只分为空白对照组、模型对照组、仙茅多糖对照组、疫苗对照组以及仙茅多糖不同剂量组.疫苗对照组以及仙茅多糖不同剂量组于第0、14 d采用流感裂解疫苗皮下注射免疫,仙茅多糖不同剂量组在两次疫苗免疫之前分别使用10、20、40 mg/kg的仙茅多糖连续肌肉注射3d.第21 d检测各组小鼠血清中特异性IgG、IgG1和IgG2a的含量,同时用流感病毒液20 μL/只滴鼻感染小鼠,观察小鼠一般情况及21 d内自然死亡情况,并检测肺脏病毒滴度及病理学变化.结果:与空白对照组相比,模型对照组小鼠有显著流感症状,11d死亡率100％,模型制备成功;与模型对照组相比,疫苗对照组小鼠肺部病毒滴度显著降低(P＜0.叭),肺组织炎症有所减轻;与疫苗对照组相比,仙茅多糖与疫苗联合免疫可显著提高小鼠血清流感病毒蛋白特异性总IgG及其亚型IgG1、IgG2a的产生水平(P＜0.05或P＜0.01),显著降低小鼠肺组织中的病毒滴度(P＜0.05),提高感染鼠的体重恢复率和生存率.结论:仙茅多糖能够辅助流感裂解疫苗提高小鼠对致死性流感病毒的抗感染能力,有望成为流感疫苗的候选佐剂.

目的:考察纯种发酵淡豆豉中异黄酮的最佳提取和纯化工艺,并考察异黄酮提取物的体外抗氧化能力.方法:以异黄酮中的主要有效成分大豆黄素和染料木素含量为指标,采用正交试验优化淡豆豉异黄酮的超声辅助提取工艺和大孔树脂纯化工艺,并考察异黄酮体外清除DPPH自由基的能力.结果:淡豆豉异黄酮超声辅助提取最佳工艺为超声时间90 min,酶量10 U,料液比1∶10,在此条件下淡豆豉中异黄酮的提取率为0.598％.使用HPD-100型大孔树脂进行分离纯化效果最好.在DPPH自由基清除实验中,淡豆豉异黄酮提取物IC50(半数有效抑制浓度)为8.18μg/mL,BHA为15.79 μg/mL.结论:按本实验结果提取的淡豆豉异黄酮提取率较高,且提取物具有显著的DPPH自由基清除效果.

目的:探讨仙茅多糖对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响.方法:采用不同浓度的仙茅多糖(500,250,125,62.5,31.25μg/mL)分别处理小鼠腹腔原代巨噬细胞和小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,36 h后加入荧光标记的大肠杆菌,室温避光孵育1.5 h,荧光显微镜下观察不同剂量的仙茅多糖对两类细胞吞噬大肠杆菌活性的影响.结论:仙茅多糖呈剂量依赖性增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能.

目的:优化纯种发酵淡豆豉的制备工艺,明确工艺参数,为纯种发酵淡豆豉的质量控制提供依据.方法:以样本中大豆黄素和染料木素的含量为指标,分别考察不同原料和辅料的使用及发酵时间对其质量的影响,从而规范纯种发酵淡豆豉的制备工艺.结果:纯种发酵淡豆豉最佳制备方法为以黑大豆为原料,青蒿、桑叶各20g,用水浸泡辅料20～30min后煎煮3次,每次1h,合并煎煮液并定容至2L,拌入200g黑大豆中,105℃灭菌15min.接菌比例为大豆30g∶菌液10mL,发酵温度为25℃,发酵时间为9d.结论:优化工艺适合纯种发酵淡豆豉的制备.

目的 探讨仙茅多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的促活化作用及对细胞表面Dectin-1受体表达的影响.方法 采用不同浓度的仙茅多糖(500,250,125,62.5,31.25μg/ml)处理细胞36h,MTT法测细胞活性,ELISA法测TNF-α分泌量,Griess法测NO的分泌量,qRT-PCR测细胞Dectin-1 mRNA的相对表达量.采用Dectin-1受体抑制剂昆布多糖(终浓度为50和100μmol/ml)对细胞预处理2h后,再用仙茅多糖刺激,qRT-PCR测细胞TNF-α和iNOS mRNA的相对表达量,流式细胞术检测细胞吞噬FITC标记的大肠杆菌的能力.结果 RAW264.7细胞受到仙茅多糖刺激后,Dectin-1 mRNA表达量较正常对照组显著增加(P＜0.01或P＜0.05),且在一定范围内存在量-效关系和时-效关系;与正常对照组相比,仙茅多糖对RAW264.7细胞的吞噬功能和分泌活性因子TNF-α和NO的能力有提升作用(P＜0.01或P＜0.05),这种作用可以被Dectin-1受体抑制剂昆布多糖阻断.结论 仙茅多糖可以增强RAW264.7细胞的吞噬功能和分泌活性因子TNF-α和NO的能力,从而促进细胞活化,其机制可能与细胞表面Dectin-1受体有关.

目的:从体内外2个方面探讨仙茅多糖作为流感疫苗佐剂对巨噬细胞的抗原提呈能力和释放活性因子的影响.方法:在体外实验中,以小鼠巨噬细胞株RAW264.7为研究对象,用流式细胞仪检测不同浓度的仙茅多糖对细胞表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达量的影响,用ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-1、IL-6的水平;在体内实验中,以昆明种小鼠作为研究对象,仙茅多糖与流感疫苗同时注射对小鼠进行免疫,免疫3d后提取各组小鼠腹腔巨噬细胞,对其免疫效果进行评价.结果:在体外实验中,不同浓度的仙茅多糖刺激RAW264.7细胞后,细胞表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ都有不同程度表达上调,同时使培养液中TNF-α、IL-1和IL-6含量上升,与阴性对照组比较,差异显著(P＜0.05,P＜0.01);在体内实验中,不同浓度的仙茅多糖可使腹腔巨噬细胞表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ都有不同程度表达上调(P＜0.05,P＜0.01).结论:仙茅多糖在体内外可以促进小鼠巨噬细胞的抗原提呈作用,能增强流感疫苗的免疫效应,有望成为具有潜在应用价值的流感疫苗佐剂.

目的:研究仙茅提取物对小鼠巨噬细胞株RAW264.7的诱导活化作用.方法:应用水提醇沉方式制备仙茅提取物,其中多糖含量为50％.将不同浓度的仙茅提取物(31.25 ～ 500μg/ml)作用于RAW264.7细胞36h后,采用流式细胞术检测膜表面模式识别受体TLR2/4和MR的表达;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测细胞iNOS和TNF-α的mRNA表达水平;收集培养上清液,用ELISA法测定中TNF-α含量,Griess法检测NO的含量.结果:仙茅提取物的剂量在500μg/ml以下时,对细胞增殖影响不明显;与空白对照组相比,浓度高于62.5μg/ml的仙茅提取物刺激RAW264.7细胞可使TNF-a、iNOS mRNA表达量显著升高,促进细胞分泌活性因子TNF-α和NO;仙茅提取物可以有效增加RAW264.7细胞表面的模式识别受体的表达,TLR2由空白组的31.25±5.19上升到39.82±4.53,TLR4由空白组的6.41±2.44上升到24.34±5.22,MR由空白组的7.35±3.54上升到36.24±9.53,且均呈现剂量-反应关系.结论:仙茅提取物可能通过影响巨噬细胞膜表面部分模式识别受体的表达使TNF-α和NO的分泌量增多,诱导巨噬细胞活化,具有潜在的免疫调节价值,此作用与仙茅传统用于治疗虚劳内伤、现代用于免疫调节的临床应用有关.