目的:建立重组人乙酰胆碱酯酶(rhAChE)抑制剂体外筛选模型,并应用该模型对中药单体进行抑制剂的初步筛选.方法:运用pCMV-AChE表达质粒转染HEK293细胞,通过DEAE-Sepharose FF柱纯化酶液,获得更高纯度和活性的纯化酶,并建立其活性检测方法,同时结合SDS-PAGE及Western blot验证模型成功与否;以AChE的可逆性抑制剂多奈哌齐为阳性药,运用该模型探究小檗碱、血根碱和蛇根碱对AChE的影响.结果:纯化液比活力为15.93 U·mg-1,纯化倍数为9.63,酶活回收率为56％;Western blot结果显示在68×103g·mol-1附近出现明显的rhAChE的单一条带;测得纯化后rhAChE的IC50为5.0 nmol· L-1,明显低于纯化前(14 nmol·L-1);3个不同的化合物对rhAChE分别表现出不同程度的抑制作用,其中小檗碱的IC50接近多奈哌齐.结论:SDS-PAGE、Western blot以及多奈哌齐的阳性结果显示利用pCMV-AChE转染的HEK293细胞成功构建rhAChE抑制剂体外筛选模型,并成功运用于中药单体药物的初筛.

为构建16S rRNA甲基化酶RmtB重组菌并测定其稳定性,应用分子克隆技术构建16S rRNA甲基化酶RmtB重组菌,采用菌落PCR、双酶切、药敏试验及序列分析等方法鉴定重组质粒,测定重组菌的生长曲线及传代后的最低抑菌浓度(MICs)以确定重组菌的稳定性.结果表明,构建了16S rRNA甲基化酶RmtB重组菌pRmtB1、pRmtB2、pRmtB4.重组菌对阿米卡星、庆大霉素高度耐药.在没有抗生素选择压力下传代3次后,3株重组菌的生长曲线基本相似,但只有pRmtB1维持了对庆大霉素和阿米卡星的高度耐药性.由此可知,重组菌pRmtB1较稳定,可作为16S rRNA甲基化酶耐药抑制剂筛选模型.

为分析中药与庆大霉素联合对16S rRNA甲基化酶RmB耐药重组菌的作用,采用棋盘稀释法测定庆大霉素与黄连、五倍子、连翘、黄芩、乌梅的联合抑菌指数(frictional inhibitory concentration index,FICI).试验结果表明,黄连、五倍子、连翘、黄芩、乌梅与庆大霉素的联合抑菌指数(FICI)分别为0.75、0.25、1.50、2.00、0.75.提示中药五倍子与庆大霉素联合有协同作用,黄连、乌梅与庆大霉素联合有相加作用,连翘、黄芩与庆大霉素联合呈现无关作用.

猪细小病毒病为细小病毒感染而诱发的以母猪繁殖障碍为典型特点的病毒性传染病.患猪典型症状为死胎、木乃伊胎、流产等,严重时,可导致母畜不孕.近些年,随养猪规模的扩大,此病流行有蔓延扩散的态势.此病的发生,与圆环病毒病、蓝耳病等的混合感染,危害更大,严重影响养猪业.重视猪细小病毒病的防治,有着极为重要的现实意义.

乙酰胆碱水平降低或活性异常是阿尔茨海默病发生的主要原因,通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性,提高乙酰胆碱水平可以治疗阿尔茨海默病.因此乙酰胆碱酯酶抑制剂成为目前治疗阿尔茨海默病最有效的方法之一.近年来,从天然产物及其衍生物中筛选中药抑制剂备受关注.文章综述了近年来重组人乙酰胆碱酯酶及其中药抑制剂的研究现状.

This study is designed to obtain recombinant human acetylcholinesterase (rhAChE) and apply it in screening acetylcholinesterase inhibitors. The rhAChE was overexpressed in HEK293 cells transfected by plasmid of pCMV-AChE with the cationic liposome and rhAChE was found to be secreted into cell culture medium. AChE activity was assayed according to modified Ellman method to obtain kinetic parameters. IC so50 values for donepezil compounds of rhAChE were calculated to determine their activities of inhibition. The results showed that Km value was 151.9 micromol.L-1 donepezil inhibited rhAChE in a mixed competitive-noncompetitive way (Ki= 16.03 nmol.L-1, Ki = 18.36 nmol.L-1) and that most new compounds tested exhibited high activities of inhibition on rhAChE. The study suggests that rhAChE is available to be applied in screening AChE inhibitors in vitro.

目的 通过快速液相-四极杆飞行时间串联质谱(RRLC-QTOF)法分离、鉴定拉科酰胺粗品中4个未知杂质.方法 采用美国Agilent RRLC快速液相色谱系统和6530型四极杆-飞行时间串联质谱仪,色谱柱为XDB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为醋酸铵-水溶液(甲酸调节pH至4.5)和乙腈,梯度洗脱,流速为1.0 mL·min-1,采用柱后分流,其中质谱仪进样流速为0.3 mL·min-1.结果 结合高分辨质量数和二级质谱碎片推测得到了拉科酰胺粗品中4个可能的杂质结构.结论 本研究为拉科酰胺的质量研究提供参考.