Высокое содержание интерферона, CD4 и CD8 Т лимфоцитов обнаружено в крови и селезенке мышей, перорально вакцинированных “ранним” белком ВПЧ16 Е2 с помощью методов ELISPOT, Вестерн-блот-гибридизации и иммуноферментного анализа. Сделан вывод о том, что “ранний” белок ВПЧ16 Е2 принимает участие в активации иммунной системы в процессе контроля над патогенезом и неоплазией.

Исследования связаны с разработкой кандидатных вакцин, создаваемых на базе растительных экспрессионных систем, против опасных вирусных инфекций. Изучено влиние гена ugt в генетической конструкции, вводимой в трансформируемые растения на иммуногенность получаемого растительного вакцинного материала. Для этого провели генетическую трансформацию плодов растений томата 2 генетическими конструкциями, содержащими целевой ген высокоонкогенного типа папилломы человека hpv16 L1, вызывающего цервикальный рак, различающимися между собой наличием или отсутствием гена ugt . Полученный лиофилизированный растительный материал, содержащий антигенный белок HPV16 L1, использовали в качестве вакцинного материала для пероральной вакцинации мышей в 2 вариантах: без и с геном ugt . Результаты иммунологического исследования крови вакцинированных мышей показали статистически достоверное увеличение количества антител к HPV16 L1 при вакцинировании вакцинным материалом, содержащим ген ugt .

Для усиления синтеза антигенных белков оболочки L1 высокоонкогенных типов папилломавирусов ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31 и ВПЧ45 в генетическую конструкцию включили последовательность гена, кодирующего репликазу вируса мозаики огурца (RdRP CMV). Это позволило увеличить продукцию данных антигенных белков до 25–27 мкг на 1 мг общего растворимого белка.

При анализе свойств четырёхвалентной пероральной вакцины против цервикального рака, создаваемой с помощью экспрессионной системы на основе трансгенных плодов томата, обнаружили по результатам иммуноферментного анализа и Вестерн-блот-гибридизации, что антитела против вируса папилломы человека 16 L1 (ВПЧ16 L1) активно взаимодействовали не только с антигенными белками ВПЧ18 L1, 31 L1, 45 L1, но и с антигенным белком ВПЧ6 L1, который принадлежит к другому семейству ВПЧ. Таким образом, получены новые данные о возможности перекрёстного взаимодействия между антителами и антигенами, относящимися к отдалённым семействам ВПЧ.

The biolistic transformation of tomato callus tissue with genetic construct containing the target gene hpv16 L1 coding the synthesis of the main antigenic high risk type protein of human papillomavirus HPV16 L1 was conducted. The result of this work was the plants capable of synthesizing antigen HPV16 L1 protein in amount of up to 2 mg/mg of total soluble protein (TSP).

Присутствие липид-белковых микродоменов (рафтов) в биологических мембранах считается доказанным. Состав липидов и белков в них существенно зависит от природы мембраны и способа ее выделения. Проведен сравнительный анализ липидного состава микродоменов вакуолярной мембраны, выделенных детергентным и бездетергентным методами. Мембранные микродомены, выделенные с использованием детергентов, относятся к рафтовым структурам, которые в последнее время активно изучаются. Однако нативность этих структур вызывает большие сомнения, поэтому для выделения микродоменов был использован также более мягкий бездетергентный метод. Показано, что микродомены, выделенные из тонопласта без детергентов, по липидному составу существенно отличаются от выделенных с помощью Тритона Х-100. Это не позволяет отнести их к рафтам, несмотря на их расположение в той же опалесцирующей зоне сахарозного градиента, что и рафтов, выделенных с Тритоном Х-100. Известно, что отличительной особенностью рафтов является преобладание стеринов и сфинголипидов, однако во фракции микродоменов, выделенных без детергента, это не наблюдалось. Полученные результаты доказывают, что выделенные разными способами мембранные структуры в зависимости от наличия или отсутствия детергента представляют собой различные микродомены, которые могут иметь специфические функции.

С целью изучения роли вакуоли в адаптационных механизмах растительной клетки исследовали динамику биофизических характеристик вакуолярной мембраны под влиянием окислительного стресса. Методом конфокальной микроскопии с использованием флуоресцентных зондов (АНС и лаурдана) показано, что при окислительном стрессе изменяются биофизические характеристики мембраны, а именно, увеличивается микровязкость липидного матрикса вакуолярной мембраны. Одновременно на 40–45% снижается транспортная активность Н+-ATP-азы тонопласта. Окислительный стресс повышал в 2 раза интенсивность флуоресценции зонда АНС при взаимодействии с вакуолярной мембраной, вероятно, вследствие возникновения структурных дефектов в виде неспецифических мембранных пор. Методом цейтраферной видеосъемки показано, что в условиях окислительного стресса значительно уменьшается время полураспада вакуолей, зависящее от интенсивности стресса.

Мембраны клеток структурно неоднородны и содержат липид-белковые микродомены (рафты), в которых протекают сигнальные и транспортные процессы. Организация и свойства рафтов в растительных клетках изучены недостаточно. В данной работе исследовались рафты вакуолярной мембраны клеток корнеплодов столовой свеклы. Рафт-содержащие фракции мембран выделяли детергентным и бездетергентным методами. С помощью спектроскопических и хроматографических методов определено общее содержание белков, липидов и насыщенных жирных кислот. Степень упорядоченности липидной фазы оценивали с использованием флуоресцентного зонда лаурдана и конфокальной микроскопии. Показано, что бездетергентные препараты содержат значительно больше белков, примерно то же количество липидов и меньше насыщенных жирных кислот, чем рафты, выделенные с использованием Тритона Х-100. Упорядоченность липидной фазы была выше в рафтах, выделенных с Тритоном Х-100. Таким образом, примененные методические подходы позволяют выделять рафты из вакуолярной мембраны, оценивать их физико-химические свойства и выявлять различия характеристик препаратов, полученных разными методами.

Обнаружено изменение ферментативной активности фенолзависимой пероксидазы (ПО) вакуолей и тканевого экстракта корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) в разных фазах развития растения, а также при гиперосмотическом стрессе и инфицировании патогенами. Самая высокая активность ПО была в период роста корнеплода, а самая низкая – в период покоя. Активация фермента отмечена у инфицированных корнеплодов. Показано, что изоферментный состав ПО отличался лабильностью, значительно варьировало число катионных изоформ. В зависимости от фазы развития и стрессового воздействия изменялся оптимум pH для фермента, наблюдалась тенденция его смещения к низким значениям в период покоя и при гиперосмотическом стрессе, сдвиг оптимума pH совпадал с появлением дополнительных катионных изоформ ПО.

На разных фазах развития корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) исследовали активность и изоферментный состав фенолзависимой пероксидазы (ПО) вакуолей. Установили, что ферментативная активность повышалась во время роста и снижалась в период покоя корнеплодов. Изоферментный состав ПО тоже изменялся, дополнительные катионные и анионные изоформы были выявлены в период роста и на определенных этапах покоя. Зачастую в период покоя корнеплоды подвергаются таким видам стресса, как водный дефицит и патогенез. В связи с этим провели исследование активности фермента у корнеплодов с выраженными признаками увядания и инфицирования патогенными микроорганизмами. Активация ПО была отмечена у инфицированных корнеплодов, а увеличение числа катионных изоформ – у корнеплодов, испытывающих водный стресс. В зависимости от фазы развития и воздействия стрессора изменялись оптимумы pH для фермента: в период покоя и при водном стрессе они смещались в сторону низких значений. Сдвиг оптимумов рН происходил одновременно с появлением индуцибельных катионных изоформ. При исследовании pH-зависимости катионных ПО, которые были ассоциированы главным образом с тонопластом, обнаружили, что оптимальными для них были pH 4.0 и 5.0. Наблюдаемые изменения уровня активности и изоферментного состава предполагают активное участие ПО вакуолярной локализации в метаболических процессах и защитных реакциях клеток корнеплодов.