为了探究水禽源大肠杆菌的耐药性、耐药基因携带情况及其与质粒的相关性,试验用纸片扩散法检测62株水禽源大肠杆菌对14种抗菌药物的耐药性,用PCR方法对13种耐药基因和18种质粒进行扩增,并对质粒检出率较高的阳性菌株进行耐药基因的检测.结果表明:62株水禽源大肠杆菌对阿莫西林、美洛西林和链霉素的耐药性较高,耐药率分别为88.7％、74.2％和51.6％;对丁胺卡那和头孢哌酮耐药性较低,耐药率分别为3.2％和 1.6％.aac(6')-Ib、TEM、qnrD及qnrS基因的检出率较高,分别为 66.1％、59.7％、46.8％和 29.0％;共检出 6 种质粒 IncFIA、IncFIB、IncY、IncI1、IncHI2、IncN,其中质粒IncFIB的检出率最高,为80.6％.IncFIB阳性菌株的aac(6')-Ib基因检出率为72.0％,qnrS基因检出率为22.0％.说明水禽源大肠杆菌耐药性高,常见耐药基因以aac(6')-Ib为主,常见质粒以IncFIB为主,质粒IncFIB介导的aac(6')-Ib基因传播较为流行.

为调查不同动物源性大肠杆菌的耐药性,本试验对65株源于畜禽的大肠杆菌进行18种常见抗菌药的药敏试验,用PCR法检测3种氨基糖苷类耐药基因aac(3)-Ⅱ、arm(A)和aac(6')-Ib.结果显示:65株大肠杆菌中对氨基糖苷类药物链霉素耐药率最高(75.38％),其次为复方新诺明(69.23％),耐药率最低的是头孢哌酮舒巴坦(0％);耐药基因aac(3)-Ⅱ、arm(A)和aac(6')Ib的检出率分别为29.23％、1.54％和9.23％;有51株分离菌株存在多重耐药,占总株数的78.46％.结果表明,动物源大肠杆菌对多种抗菌药具有耐药性,在氨基糖苷类耐药基因中以携带aac(3)-Ⅱ为主.

临床见习课程是高等农业院校动物医学专业重要的实践性环节,也是国家执业兽医资格考试综合性科目的主要考查内容.介绍了扬州大学兽医学院以学生为主体、充分发挥学生主动性和参与性的案例教学模式及其应用效果.通过2届学生的具体实施,临床见习课程已成为一门具有自身特色、内容生动、方法与手段先进、考核方式新颖、师生参与性较高的实践性课程,大大提高了学生的临床诊治能力和综合素质,为其他相关专业实践课程的教学改革提供了 一定的参考和借鉴.

山羊腹泻由多种病原引起,其中结肠小袋纤毛虫和产气荚膜梭菌均为可导致山羊腹泻的重要人兽共患病原.江苏省南通市某养殖场山羊暴发以严重腹泻为主要症状的多起死亡病例.本试验通过临床解剖检查,肠道内容物镜检以及细菌分离、纯化和鉴定(革兰染色试验、细菌16S rDNA基因PCR鉴定)等方法,确诊该起病例由大量结肠小袋纤毛虫滋养体和产气荚膜梭菌混合感染所引起;细菌16S rDNA基因序列遗传进化分析显示,本试验分离的山羊产气荚膜梭菌与芬兰的猪源菌株(GenBank:CP075903.1)亲缘关系最近;毒力基因分型结果显示,该分离菌属A型产气荚膜梭菌;药敏试验结果显示,该分离菌主要对氨基糖苷类抗生素表现为耐药.本病例病原学分析结果为临床生产中山羊腹泻的防控工作提供理论依据,并提示寄生虫在混合感染疾病发生和发展中的重要性和危害性.

2019年9月,扬州大学动物医院接诊1只耳部感染的患犬.为了探明病因,本试验取患犬耳道分泌物进行细菌分离,对分离出的1株细菌进行革兰染色、生化试验、16S rDNA基因序列分析、小鼠人工感染试验和药敏试验.结果显示:分离菌株为革兰阴性双球菌,可以发酵葡萄糖、麦芽糖,不能发酵蔗糖,能还原硝酸盐,没有运动能力;经16SrDNA基因序列分析为杜马奈瑟菌(Neisseria dumasiana).人工感染试验结果显示,分离菌株可引起小鼠炎症反应和死亡,表明其感染能力较强.药敏试验结果显示,分离菌株对头孢曲松钠、美洛西林、头孢噻肟、头孢哌酮等药物敏感,对环丙沙星表现出中介.本试验从犬的耳患病处分离出1株杜马奈瑟菌,可用敏感药物头孢曲松钠内外兼用进行治疗.

为了探究鹅源产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,Cp)的生物学特性,从临床送诊的病死鹅肠道分离出4株疑似产气荚膜梭菌,菌株纯化后分别进行革兰染色、生化鉴定、16 S rDNA序列分析、分子分型和药敏试验.结果显示:4株分离菌为革兰阳性菌,仅在厌氧条件下生长,且出现典型双溶血环菌落,16 S rDNA鉴定为产气荚膜梭菌,分别命名Cp1、Cp2、Cp3和Cp4;经多重PCR鉴定,4株菌仅含α毒素,无其他毒素,故属于A型产气荚膜梭菌;药敏结果显示4株菌对链霉素、庆大霉素、复方新诺明、多黏菌素B等多种抗生素耐药,对阿莫西林、头孢曲松钠、环丙沙星、氟苯尼考等敏感.综上所述,从临床病鹅分离到4株A型Cp,为鹅源Cp的生物特性研究提供了参考材料.

为了对送检奶牛肺脏组织进行病原菌的分离鉴定并研究分离病原菌的生物学特性,试验采用细菌的分离纯化、革兰氏染色镜检、理化试验及16S rDNA序列分析对分离菌进行鉴定,并检测其血清型、多位点序列分型(MLST)、毒力基因、致病性和耐药性.结果表明:该菌株能发酵葡萄糖、乳糖和麦芽糖等,不发酵甘露糖;革兰氏染色镜检显示该菌呈红色的球杆状,为革兰氏阴性菌;16S rDNA序列分析结果显示该菌株为溶血性曼氏杆菌,命名为202102NF,为血清型1型;202102NF的7个管家基因 adk、aroE、deoD、gapDH、gnd、mdh 和 zwf 序列号分别为 1,2,1,2,1,2,1,序列型为 ST1;202102NF 携带 LKTA、GCP、POMA、NANH、ADHE、HF 等多种毒力基因;小鼠腹腔注射 202102NF 18 h内死亡,镜检可见攻毒组的小鼠肝脏和肾脏发生肿大、颜色加深,肺部出现出血斑,肠道有大量炎性渗出物;202102NF对诺氟沙星中介,对多黏菌素B、头孢噻肟、左氧氟沙星等17种抗菌药物均敏感.说明202102NF为血清型1型的溶血性曼氏杆菌,其序列型为ST1,携带多种毒力基因,具有较强的毒力,并对多种抗生素敏感.

为获得纯度更高的吡虫啉人工半抗原,通过对常规半抗原合成的反应顺序、试剂等进行调整和优化,筛选出最适3-巯基丙酸反应比例,采用薄层层析色谱法、质谱法和核磁共振法对合成的吡虫啉半抗原分子结构进行确证,进一步用合成的吡虫啉半抗原与载体蛋白偶联得到吡虫啉完全抗原并免疫小鼠,于三免和五免7天后断尾采血,采用间接ELISA法测定小鼠血清抗体效价.结果表明:1)吡虫啉、反应体系、有机相和水相的比移值分别为0.55、0.23,0.50和0;2)质荷比为326的峰是吡虫啉半抗原的分子离子峰,且其余杂质离子峰的数量明显下降;3)核磁共振结果与吡虫啉半抗原相符,3-巯基丙酸氧化副产物峰下降;4)三免后,小鼠血清效价达到1:12 800,五免后,小鼠血清效价可达1:51 200.综上,此优化方法不仅保证3-巯基丙酸完全反应,还减少3-巯基丙酸氧化副产物和不必要杂质的产生,提供了 一种操作简单、安全,同时可减少半抗原合成过程杂质产生的吡虫啉半抗原合成优化方法,为后续吡虫啉单克隆抗体的制备提供便利.

近年来,禽霉菌病对养禽业造成了一定的危害和损失.为了解当前禽霉菌病流行的主要病原体,于2020年6-7月在扬州大学动物医院畜禽门诊采集了3例确诊为鸡霉菌感染病例的肺脏病料,分离、培养、纯化获得霉菌分离株,并对其进行染色镜检观察和内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)扩增分析.结果显示:从3例病例中分离出2株黄曲霉菌、1株烟曲霉菌.结果表明,2020年6-7月该门诊中鸡曲霉菌病例存在黄曲霉菌或烟曲霉菌感染.

为研究复方白头翁散对鹅源沙门菌优势流行株的抑制效果.2017年5月—2018年7月共收集扬州、滁州和泰州等10个地区送检的病死鹅的肝脏、胆汁和盲肠内容物等病料共计214份,随即进行沙门菌的分离鉴定.结果显示:沙门菌分离率为23.4％(50/214),其中鼠伤寒沙门菌占60％(30/50),为优势血清型;药敏试验结果显示,36株沙门菌具多重耐药性,其中鼠伤寒沙门菌占20株;结晶紫染色试验结果显示,86.7％(26/30)的鼠伤寒沙门菌能够形成生物被膜;体外试验结果显示,复方白头翁散对鼠伤寒沙门菌最小抑菌浓度(MIC)范围为23.44～375.00 mg/mL,最小杀菌浓度(MBC)范围为46.87～375.00 mg/mL;93.75 mg/mL复方白头翁散可抑制此26株细菌生物被膜的形成.结果表明鼠伤寒沙门菌是鹅源沙门菌优势血清型,也是感染鹅的一个重要的病原体,复方白头翁散能有效地抑制鼠伤寒沙门菌.

为了解禽源性大肠杆菌的多重耐药机制,对禽临床样品分离株进行了药敏试验、多重耐药调控基因soxS基因及氟喹诺酮类耐药基因检测.药敏试验结果显示,从禽临床样品分离出的12株大肠杆菌中,6株对氟喹诺酮类抗菌药物耐药,11株对氨基糖苷类抗菌药物耐药,12株对四环素类抗菌药物耐药和酰胺醇类耐药.PCR检测结果显示,12株禽源大肠杆菌均携带soxS基因,表明禽源大肠杆菌多重耐药与soxS基因关系密切.序列分析结果显示,7株大肠杆菌soxS基因无突变,4株存在点突变并导致A12S替换,2株soxS突变菌株同时携带氟喹诺酮类耐药基因qnrS.因此,12株禽源大肠杆菌具有多重耐药性,可能与soxS基因调控相关,突变株的出现增强了氟喹诺酮类的耐药性.

[背景]鸭疫里默氏杆菌感染是危害水禽业最严重的细菌传染性病之一,鹅源鸭疫里默氏杆菌病的发病率有逐渐增高趋势,给养鹅业带来了巨大经济损失.[目的]为更好地预防控制鹅源鸭疫里默氏杆菌病、解决鹅养殖场临床用药问题及进一步探究鸭源和鹅源鸭疫里默氏杆菌之间的关系.[方法]对江苏地区的发病鹅进行鸭疫里默氏杆菌的分离培养、多重PCR方法鉴定及生化试验,并对分离获得的10株鸭疫里默氏杆菌进行药敏试验、血清型鉴定及雏鸭致病性试验.[结果]药敏试验结果显示,鹅源分离菌株对大观霉素、磺胺异噁唑、头孢曲松、头孢拉定、氟苯尼考最敏感,对新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素和克林霉素耐药性最高且多重耐药性严重.血清型鉴定表明,江苏地区分离的10株鹅源鸭疫里默氏杆菌主要以血清型2型为主.雏鸭致病性试验表明,鹅源鸭疫里默氏杆菌分离株均引起雏鸭不同程度发病,其中3株鹅源临床分离株经1×107 CFU/羽攻毒后可引起雏鸭100％的致死率.[结论]为鹅源鸭疫里默氏杆菌的预防控制、临床治疗及进一步研究鸭源和鹅源鸭疫里默氏杆菌之间的关系提供依据.

为了解扬州及周边地区猪源大肠杆菌的黏附素相关基因携带情况及其耐药性,本试验采集扬州大学动物医院就诊的病死猪的肝和脾等组织,进行细菌学分离鉴定;用PCR法检测分析猪源大肠杆菌分离株常见的8种黏附素相关基因:fimH、papA、papC、papG allele Ⅰ、papG alleleⅢ、focA、focG和sfaS;并用药敏试验检测分离菌株的耐药性.结果显示,从送检样品中分离出25株大肠杆菌,25株分离菌中有40％的菌株携带fimH,8％的菌株携带papC,4％的菌株携带focG,其余基因未检测出;分离菌株对多西环素、卡那霉素、复方新诺明和氟苯尼考等耐药,对丁胺卡那敏感.由于黏附素相关基因fimH、papC和focG的存在,扬州及周边地区分离出的部分猪源大肠杆菌株具有尿路感染的潜力.

为探究羊源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)的生物学特性,对3份送检病死羊的肺脏组织进行细菌分离,将分离到的3株菌株分别命名为P1、P2和P3.3株菌株经多杀性巴氏杆菌特异性基因kmt PCR扩增阳性,随后检测荚膜血清型、多位点序列分型、18种毒力基因、药物敏感性和致病性.结果表明:3株分离株均为荚膜血清型D型多杀性巴氏杆菌,P1和P2序列型均为ST131,P3序列型为ST320;3株菌株的毒力基因各不相同,P1—P3均携带毒力基因RpoB、OmpH、ToxA、NanH,P3携带HgbA基因,P2携带pfhA基因,P1和P2携带SodA基因.该菌攻毒小鼠6 h后死亡,然而,采取相同的剂量攻毒白羽鸡未发生死亡;药敏结果显示3株分离株对左氧氟沙星、诺氟沙星、丁胺卡那、美洛西林、头孢曲松钠、复方新诺明敏感,对多黏菌素B、多西环素耐药.综合而言,从临床分离的3株羊源多杀性巴氏杆菌,荚膜血清型均为D型,基因型、毒力基因和致病性具有独特性,对小鼠致病力较强,对鸡致病力较弱.

从病死鹳的肝和肠分离出疑似产气荚膜梭菌,纯化后进行革兰染色、生化试验、16S rDNA基因序列分析和毒素鉴定、动物试验及药敏试验.结果 表明,分离的菌株为革兰阳性杆菌,能够发酵甘露糖和麦芽糖等糖类,不能发酵棉子糖和甘露醇;16S rDNA基因序列分析确定为产气荚膜梭菌序列;多重PCR结果显示,该菌仅含有α毒素基因,因而确定分离菌为A型产气荚膜梭菌.动物试验结果显示,将该产气荚膜梭菌灌服鸡48 h后,鸡肠道有较多出血点,但未表现坏死性肠炎症状.药敏试验结果显示,该菌对阿莫西林、头孢哌酮、氟苯尼考、美洛西林等药物敏感,对多黏菌素B、链霉素、卡那霉素等药物不敏感,对环丙沙星和庆大霉素中敏.

2020年4月,扬州某海洋馆1只海豚发生死亡.为了调查其死亡原因,对死亡海豚进行病理剖检,采集肺脏、肝脏和肾脏等组织进行病原的分离鉴定.随后将分离到的菌株分别进行染色镜检、生化试验、16S rDNA序列分析法鉴定种属,致病性试验及药敏试验研究其生物学特性.结果显示:从送检海豚组织中分离出的细菌在绵羊血平板上均呈灰白色的菌落,革兰染色为单个或双个的阴性球菌;分离菌对葡萄糖、乳糖、蔗糖、硝酸盐、鸟氨酸等反应均为阴性;16S rDNA序列分析法鉴定分离菌为Kerstersia gyiorum;致病性试验采用腹腔注射的方式对小鼠攻毒,小鼠感染后24 h死亡;药敏试验结果表明,该分离菌株对头孢哌酮、妥布霉素和复方新诺明等敏感性较强,对诺氟沙星、环丙沙星耐药.

根据TGEV的M基因、PEDV的M基因和PoRV的VP2基因序列,通过优化引物、探针浓度和退火温度,确定了最佳的反应体系和扩增程序,成功建立了这3种病毒的TaqMan探针单重荧光定量PCR方法.在此基础上,经过进一步的条件优化,建立了检测TGEV、PEDV、PoRV的三重实时荧光定量PCR方法,该方法对TGEV、PEDV、PoRV的检测灵敏度分别为2.49 copies/μL、4.36 copies/μL、4.96 copies/μL,TGEV、PEDV、PoRV的组内重复试验的CV最大值分别为2.5％、3.8％、4.3％,组间重复性试验的CV最大值分别为3.7％、3.4％、3.2％,均不超过5％,表明建立的方法重复性好;用此方法对PRV、PCV1、PRRSV病毒样本进行检测,均没有交叉反应,表明该方法特异性好;用建立的方法对临床40份病料样品进行了检测,结果显示,TGEV、PEDV、PoRV的阳性检出率分别为5％、30％、12.5％;其中TGEV与PEDV混合感染率为2.5％;PEDV与PoRV混合感染率为5％;多重荧光定量PCR方法与单一荧光RT-PCR方法的检测结果均一致表明建立的方法且有很好的临床府用价值.

为了确定扬州市某猪场发病猪的病原,对该猪场送检的病猪心脏进行了细菌分离与培养.通过16S rDNA测序和gdh基因PCR扩增,确定细菌种类;用血清型特异性引物进行PCR扩增,确定分离菌株的血清型;通过生长曲线测定、小鼠感染试验和药敏试验对分离菌株的生物学特性进行研究.结果表明,分离菌株为猪链球菌2型;分离菌株的生长情况与猪链球菌2型SC19菌株相似,但最高OD595值略低于SC19菌株;分离菌株对小鼠具有高致病性;分离菌株主要对青霉素类和头孢类药物敏感.这说明猪链球菌2型很可能是该猪场发病猪的病原,该猪场对猪链球菌感染的防控应优先选用青霉素类和头孢类药物.

为了调查鸭疫里默氏杆菌3种氨基糖苷类耐药基因aac (3)-Ⅱ、aadA、aac (6')-Ⅱ的携带情况,探讨耐药基因与氨基糖苷类药物表型的相关性,试验选用常用氨基糖苷类抗生素对20株来自扬州、苏州、滁州、泰兴、淮安、南京地区的鸭疫里默氏杆菌进行药敏试验,用PCR法检测耐药基因aac(3)-Ⅱ、aadA、aac(6')-Ⅱ,结晶紫染色法检测生物被膜形成能力.结果 表明:20株鸭疫里默氏杆菌对氨基糖苷类药物中的妥布霉素耐药率最高,其次是多黏菌素B、庆大霉素和诺氟沙星,最后是丁胺卡那和链霉素;耐药基因aac (3)-Ⅱ、aadA与aac(6')-Ⅱ的检出率均为0;20株鸭疫里默氏杆菌均能形成生物被膜,但0D595值均在0.31～1.00之间,为弱生物被膜.说明鸭疫里默氏杆菌对氨基糖苷类药物具有强耐药性,且应少用妥布霉素等氨基糖苷类药物.

为了分离新型曼氏杆菌并研究其生物学特性,试验对从两例山羊病例中分离出的相似细菌进行纯化培养,通过革兰氏染色镜检、生化试验、16S rDNA基因序列测定、多位点序列分型法(MLST)鉴定、血清型鉴定、药敏试验等方法研究其生物学特性.结果 表明:分离得到2株革兰氏阴性菌,2株细菌的生化试验和16S rDNA基因序列分析鉴定符合溶血性曼氏杆菌的特点,将其分别命名为201705YF和201805YS;对2株细菌进行血清型1型、2型和6型的多重PCR鉴定,201705YF为血清型2型,而201805YS的1型、2型和6型血清型检测为阴性;对2株细菌的7个管家基因adk、aroE、deoD、gapDH、gnd、mdh和zwf进行扩增并测序,菌株201705YF对应的7个管家基因的序列号为50,20,15,19,15,17,19,菌株201805YS对应的7个管家基因的序列号为1,2,20,2,1,1,1,这2株细菌的基因型为新基因型,即ST50和ST51;2株细菌对左氧氟沙星、卡那霉素、多黏菌素B、氟苯尼考、诺氟沙星、多西环素、美洛西林、环丙沙星、头孢哌酮等抗生素敏感,但201705YF对丁胺卡那耐药,201805YS对庆大霉素、新霉素、妥布霉素耐药.说明从送检病死山羊中分离出的2株细菌为不同血清型和新ST型的溶血性曼氏杆菌,为溶血性曼氏杆菌进化和流行病学关系研究提供了新的相关研究数据.