为提高高校实验室的管理水平和技术能力,出具具有法律效力的检测报告,扬州大学动物疾病检测与技术服务中心于 2018 年 1 月通过江苏省CMA认证,成为江苏高校系统动物疾病检测领域首个通过CMA认证的第三方检测实验室.依据资质认定的最新要求,结合高校实验室工作的实际情况,从中心资质认定体系的建立、试运行、现场评审及正式运行四个方面,系统阐述了高校动检实验室资质认定体系建成的整个过程,对高校检测实验室的建设具有一定的意义.

2019年10月21日—12月中旬,江苏某动物园小熊猫(Ailurus fulgens)出现疑似犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染,用犬瘟热胶体金试纸条检测,结果为弱阳性,共12只小熊猫死亡.对病死小熊猫剖检,可见明显的肺充血、出血,肝肿大,心内膜出血,胃肠黏膜出血.采集2只发病小熊猫尾静脉血送检,RT-PCR检测犬瘟热核酸为阳性,用Vero-CD150细胞对样品进行病毒分离,在Vero细胞上连续传代,通过RT-PCR检测,病毒核酸仍然为阳性,最终分离到2株犬瘟热病毒,分别命名为SZ2019CDV1H和SZ2019CDV2H.扩增H基因并测序,与GenBank已公布的基因序列进行同源性比较和遗传发生分析,SZ2019CDV1H株与SZ2019CDV2H株的基因同源性为97.2％.在遗传发生关系树上,SZ2019CDV1H株为Africa毒株,SZ2019CDV2H株为Eu-ropean wildlife毒株,分属于不同的遗传分支.

为验证一种新的CRISPR分型方法——CSST分型方法分型沙门氏菌的可行性,分别采用传统CRISPR与CSST两种分型方法,对20株临床肠道沙门氏菌分离株进行分型.结果显示:CSST分型方法同传统CRISPR分型方法分型沙门氏菌的结果完全一致,均将20株临床肠道沙门氏菌菌株分成了15种亚型,其中CR4/CT4和CR9/CT9为最优势CR/CT型,而其他CR/CT型均呈零星分布.结果表明,CSST分型方法可用于肠道沙门氏菌分型,且比传统CRISPR分型方法更简洁、方便.本研究为沙门氏菌的流行病学溯源提供了重要技术方法.

山羊腹泻由多种病原引起,其中结肠小袋纤毛虫和产气荚膜梭菌均为可导致山羊腹泻的重要人兽共患病原.江苏省南通市某养殖场山羊暴发以严重腹泻为主要症状的多起死亡病例.本试验通过临床解剖检查,肠道内容物镜检以及细菌分离、纯化和鉴定(革兰染色试验、细菌16S rDNA基因PCR鉴定)等方法,确诊该起病例由大量结肠小袋纤毛虫滋养体和产气荚膜梭菌混合感染所引起;细菌16S rDNA基因序列遗传进化分析显示,本试验分离的山羊产气荚膜梭菌与芬兰的猪源菌株(GenBank:CP075903.1)亲缘关系最近;毒力基因分型结果显示,该分离菌属A型产气荚膜梭菌;药敏试验结果显示,该分离菌主要对氨基糖苷类抗生素表现为耐药.本病例病原学分析结果为临床生产中山羊腹泻的防控工作提供理论依据,并提示寄生虫在混合感染疾病发生和发展中的重要性和危害性.

2020年8月底,江苏省某猪场断尾、阉割仔猪出现大量急性死亡,病情持续2个月左右.为确诊引起死亡的原因,11月中旬,对送检的4只发病仔猪进行了剖检和实验室诊断.根据流行史、临床症状、剖检病变,以及心血涂片和脏器触片检查结果进行初步诊断,结合细菌和分子生物学检测结果进行确诊.结果显示:剖检病变多呈黄染、败血性变化,脏器触片检查观察到大量球形、圆形蓝紫色细菌;经16S rRNA序列比对,病变组织中分离、纯化的细菌被鉴定为溶血性葡萄球菌;心血涂片检查发现大量红细胞变形,呈星芒状、锯齿状和半月状等不规则形状,符合附红细胞体特征,且经PCR扩增出特异性条带.最终确诊,引起该规模猪场仔猪死亡的病因为附红细胞体与溶血性葡萄球菌混合感染.根据诊断结果针对性给药,5 d后该猪场疫情得到有效控制.本病例的诊断结合了现代分子生物学方法和经典检测方法,这对于混合感染的诊断有着重要作用.

从池塘中分离、纯化了1株具有极强溶血活性的革兰氏阴性杆菌BB2,在TSA培养基上菌落呈灰色、半透明圆形,经16S rRNA基因序列分析确定为色杆菌属,但无法确定到种;进一步全基因组测序结果表明,该菌株与GenBank中唯一的1株稻根色杆菌基因组同源性最高,但生物学特性又不一致.文献逆索发现其命名为稻根色杆菌主要是由于其分离于水稻根部,这对分类造成了困惑.最终依据细菌形态特征、生理生化特性、16S rRNA和全基因组序列分析及文献分析等综合信息,确定分离菌BB2为溶血色杆菌,这提醒研究者们在细菌鉴定时应谨慎使用GenBank数据序列数据,一定要对相关参考文献进行全面认真研读,获取必要的证据,为最终分类提供科学依据.本研究也为进一步研究该分离株的生物学特性和应用提供了参考和基础.

为了明确致猫呼吸道症状的病原菌及该菌的病原特征及其基因组功能信息,本研究对采集的3例发病猫的鼻腔拭子进行病原菌的分离、纯化及生化和16S rRNA基因的PCR鉴定;采用纸片法检测分离菌的药物敏感性及其对小鼠的致病性.并对其中一株分离菌进行基因组的生物信息学分析,利用不同的数据库对基因组编码的蛋白进行功能注释以及耐药和毒力相关基因的预测.细菌的分离及鉴定结果显示:分离出3株支气管败血波氏杆菌(Bb).药敏试验结果显示,分离菌对丁胺卡那、卡那霉素、四环素、氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星和氯霉素敏感,对氨苄西林、链霉素、利福平、磷霉素和呋喃唑酮耐药;致病性试验结果显示,3株分离的Bb对小鼠均有一定的致病性,且浓度越高致病性越强.基因组分析结果显示,其中一株菌基因组大小为4520328 bp,GC％含量为68.12％,含有4690个蛋白质编码基因,87个tRNA基因,25个rRNA基因,1个tmRNA基因等信息;分离菌基因组编码蛋白功能的注释结果显示该菌的功能蛋白主要表现在细菌的复制增殖和生物代谢方面;分离菌携带多种耐药基因,包括主动外排系统相关基因、多粘菌素抗性基因、磷霉素抗性基因等,并基本与耐药表型一致;携带66种毒力基因,主要是分泌系统类毒力基因以及内外毒素、黏附侵袭类毒力因子基因.上述结果表明,本研究分离的Bb耐药性不强,但对小鼠呈强致病力,且含多种毒力相关基因.本研究为对该菌的研究奠定基础,并为该菌感染的防控研究提供参考.

近年来,禽霉菌病对养禽业造成了一定的危害和损失.为了解当前禽霉菌病流行的主要病原体,于2020年6-7月在扬州大学动物医院畜禽门诊采集了3例确诊为鸡霉菌感染病例的肺脏病料,分离、培养、纯化获得霉菌分离株,并对其进行染色镜检观察和内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)扩增分析.结果显示:从3例病例中分离出2株黄曲霉菌、1株烟曲霉菌.结果表明,2020年6-7月该门诊中鸡曲霉菌病例存在黄曲霉菌或烟曲霉菌感染.

2020年5月,江苏省某养殖场饲养的220只山羊疑似感染产气荚膜梭菌,共死亡25只.为鉴定感染的产气荚膜梭菌复合群类型,采集大肠、小肠内容物以及肠系膜淋巴结、肝、脾、肾等组织病料进行细菌分离鉴定,并对分离菌株进行药敏试验及致病性试验.结果显示:分离菌株为革兰氏阴性短杆菌,经生化试验和16S rRNA试验鉴定为豚鼠气单胞菌;该分离株对多种常用抗菌药物耐药,仅对呋喃唑酮敏感;该菌能造成小鼠发病死亡.此次从临床发病羊病料中分离到致病性豚鼠气单胞菌,在国内较为少见,截至目前未见类似报道,本研究为避免此类疫病的临床误诊以及做好该病防控提供了帮助.

为了解鸭甲型病毒性肝炎的病原特征,对2017-2019年从山东省采集的27份疑似鸭肝炎病毒感染的病料采用鸡胚进行病毒分离,并进行RT-PCR鉴定,随后对分离株的VP1基因进行序列测定以及遗传变异分析.结果显示:从27份疑似病料中共分离出了22株病毒,8株为鸭甲肝病毒1型(DHAV-1),14株为鸭甲肝病毒3型(DHAV-3);VP1基因序列比对显示:8株DHAV-1与12株参考株的核苷酸相似性为91.7％～98.6％,氨基酸相似性为93.7％～97.5％,分离株的核苷酸相似性为97.2％～100％;14株DHAV-3与12株参考株的核苷酸相似性为89.4％～98.9％,氨基酸相似性为92.1％～100％,分离株的核苷酸相似性为93.9％～100％,属于Ⅰ型(G Ⅰ型).研究结果将为鸭甲型病毒性肝炎的防控提供了参考.

2018年7月份,扬州大学动物医院接收到宿迁送检的1份羊驼病料,根据发病情况及剖检结果怀疑为产气荚膜梭菌感染,对其肠道、肝脏、肾脏病料进行厌氧菌分离培养,对分离菌进行了纯化、革兰染色、生化反应、16S rRNA基因序列分析以及药敏实验.结果 表明:分离菌为产气荚膜梭菌,该菌对环丙沙星、氟霉素、氨苄西林敏感.

我国茶叶特别是发酵茶叶中含有许多有益真菌,其代谢产物具有抗菌、抗癌、降脂、降压的功能.目前,关于茶叶中真菌功能的研究很多,但在畜牧业中尚无相关应用研究.取湖南安化金花茯砖茶、天福南糯山熟饼、天福茗茶、天福白茶、安吉普洱茶、天福普洱、祁门红茶和金茯茶共8种茶叶进行真菌分离、纯化,共得到23株菌株,通过形态学和ITS基因序列的鉴定,共得到拟茎点霉菌1株,变色栓菌1株,枝状枝孢菌1株,黑曲霉2株,曲霉菌1株,冠突曲霉2株,阿姆斯特丹曲霉6株,棕曲霉2株,格孢菌1株,扩展青霉菌1株,拟盘多毛孢菌1株,球孢枝孢菌2株,变色曲霉2株.结果 为这些真菌的进一步研究和在生产实践中的应用提供了物质基础.并且将其中的优势菌属冠突散囊菌进行扩大培养,为后期的生产实践做好准备.

子宫蓄脓是一种常见的犬生殖系统疾病,通常由内分泌紊乱和细菌感染共同引起.为了解兽医临床子宫蓄脓病例中的常见病原菌类型,对江苏省扬州市动物医院接诊的7例子宫蓄脓病例进行病原菌分离鉴定.经实验室检测,分离出10株菌株;经序列分析,鉴定出5种病原菌,分别为大肠杆菌(3株)、粪肠球菌(1株)、产气肠杆菌(2株)、产酸克雷伯氏菌(1株)、铜绿假单胞菌(3株).结果表明,该地区犬子宫蓄脓病例感染的致病菌种类较多,但以肠杆菌科细菌为主.本研究为临床犬子宫蓄脓的防治提供了参考.

为了研究我国新型新城疫病毒的分子流行病学特性,对2016年从主动监测中分离到的1株新出现的鸭源新城疫病毒(duck/China/NX2209/2016)进行了基因组测序和遗传进化分析.序列分析结果显示该分离株全长15198 nt,F基因ORF全长为1 662 bp,共编码553个氨基酸,裂解位点处的氨基酸为:112 ERQERL117,符合低致病性新城疫病毒特征.同源性分析表明该新型毒株同北美分离株具有较高的同源性.F基因高变区进化分析结果显示,该病毒属于Class Ⅰ,但不属于基因型1～10,为新型毒株.完整F基因进化树结果显示,该病毒属于基因1c亚型,与北美分离株高度同源.

随着社会的需求,第三方检验检测机构的数量日益增多.检测数据的准确性不仅关乎检测机构的检测水平,也直接影响行政机关的执法效力,因此检测实验室必须确保其检测数据科学公正、准确可靠.核酸检测是第三方检验检测机构中最常见的检测项目,而气溶胶污染是核酸检测中最主要最常见的污染,也是困扰绝大多数实验室的难题,必须要加以重视.本文就本中心在核酸检测防污染方面的体会进行初步总结.

为了分析我国新出现的Ⅰ类新城疫病毒的分布和分子特性，对2016年分离到的4株Ⅰ类新城疫病毒进行F基因序列分析和遗传进化分析。结果显示：4株Ⅰ类新城疫病毒F基因编码长度均为1 662 nt，共编码553个氨基酸，分离株之间氨基酸相似性为97.9%~100%。4株分离株F蛋白裂解位点的氨基酸组成均为112ERQERL117，符合新城疫病毒弱毒株的分子特征。F基因高变区（47-420 nt）遗传进化分析结果显示这4株病毒为国内新出现的基因型，利用F基因编码区全长序列构建系统进化树显示4株病毒属于基因1c亚型，与北美分离株高度同源，而与国内基因1c亚型分离株（Duck/Guangxi/1261/2015）相似性仅为95.5%~97%。监测数据表明这种新出现的Ⅰ类新城疫病毒具有在国内进一步流行和扩散的风险。

2014年12月份,扬州大学动物医院接收到某动物园送检的一份马鹿病料,根据发病情况及剖检变化怀疑为产气荚膜梭菌感染,对其肠道、肝脏、肾脏、脾脏病料进行厌氧分离培养,分离到了粗大杆菌,对分离菌进行了纯化、革兰氏染色、生化反应、16S rRNA基因序列分析.结果表明:分离菌为产气荚膜梭菌.采取药敏纸片法进行药敏试验,结果该菌对痢特灵、氯霉素、氟苯尼考敏感性较强.

2014年10月-2015年2月,扬州大学动物医院畜禽门诊接诊了11例来自于扬州、南通地区的山羊腹泻病例,经临床症状分析和问诊,初步怀疑为产气荚膜梭菌感染.通过剖检,取肠道、肝、肾进行恒温厌氧分离培养,培养后得到表面光滑、半透明、圆屋顶状的菌落,经纯化、革兰染色、镜检以及生化特性分析,结果为产气荚膜梭菌.采取药敏纸片法进行药敏试验,结果显示,其对氟苯尼考的敏感性较强.

[Objective] Based on the difference of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), avian influenza viruses (AIVs) are classified into 16 hemagglutinin (HA) and 9 neuraminidase (NA) subtypes. According to the differences in pathogenicity, AIVs can be divided into highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) and low pathogenic avian influenza virus (LPAIV). H4 AIVs are low pathogenic influenza viruses which are generally produced asymptomatic infections in poultry. But H4 AIVs also has potential threats to both poultry and mammals. Strengthening investigation on H4 subtype avian influenza viruses is important for the study of evolution of AIVs. The objective of this experiment is to investigate the molecule characteristics and genetic evolution of H4 subtype avian influenza virus.[Method]One H4N8 subtype avian influenza virus, designated as A/duck/Nanjing/1102/2010 (H4N8) <br> (DK/NJ/1102), was isolated from a live poultry market in eastern China during epidemiological surveillance in 2010. The complete genome sequences of the strain was sequenced and analyzed. The virus was identified by HA/HI test and RT-PCR test. The gene was cloned into pGEM-Teasy vector for sequencing, respectively. BLAST the nucleotide identity in GeneBank. The genome sequences of H4 subtype influenza viruses available in GeneBank and some other reference sequences were downloaded for genetic analysis .[Result]The results showed that the HA gene of DK/NJ/1102 had the highest nucleotide sequence identity of 98.9% with A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3), and the amino acid sequence at the cleavage region of the HA gene was “P-E-K-A-S-R-G”, which is typical for low pathogenicity AIVs. NA gene had the highest nucleotide sequence identity of 98.8% with a duck-origin virus A/Duck/Eastern China/n91/2009 (H3N8) isolated from eastern China, whereas PB1, PA and NP genes were all mostly related with H1 subtype avian influenza viruses. The M gene shared the greatest nucleotide sequence identities (over 99.9%) with A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1) while the NS gene was most closely related to H7N7 subtype AIV isolated from Korea in 2009 and there was no amino acids missing in NS1 protein at 80-84 sites.[Conclusion]These data indicated that the genome composition of the strain A/duck/ Nanjing/1102/2010(H4N8) was complicated, it may be a reassortant whose genes originated from different subtypes of AIV.

2007-2013年,在江苏省扬州市和苏州市的病犬临床样本中共分离鉴定了11株犬细小病毒(CPV).经过VP2特定位置氨基酸的比较分析,证明其中9株为CPV-2a,1株为CPV-2b,1株为CPV-2.部分CPV-2a/b分离毒株在VP2蛋白氨基酸位点300位或440位有新的突变,VP2基因进化树分析表明,大部分江苏毒株在同1个独立分支中.