Изучено влияние эндогенного циклического дипептида цикло-L-пролилглицина (ЦПГ) и пирацетама на содержание мозгового нейротрофического фактора (BDNF), фактора роста нервов (NGF) и белка теплового шока Hsp70 на иммортализованных клетках гиппокампа мыши линии HT-22 в условиях токсического воздействия, вызванного глутаматом, и на культуре нейробластомы человека линии SH-SY5Y в условиях токсического воздействия, вызванного 6-гидроксидофамином. Показано, что ЦПГ (10–3, 10–7 М) увеличивает содержание как нейротрофинов BDNF и NGF, так и Hsp70, тогда как пирацетам (10–3 М) увеличивает содержание только нейротрофинов. Высказано предположение о возможном участии BDNF и NGF в механизмах действия нейропептида ЦПГ и пирацетама. Кроме того, в эффектах ЦПГ выявлено новое звено цитопротекции, связанное с белком теплового шока Hsp70.

Исследована нейропротекторная активность оригинальных лигандов транслокаторного белка 18 кДа (TSPO) соединений ГМЛ-1 и ГМЛ-3 in vitro. Окислительный стресс, вызванный H2O2 (1,5 мМ), приводил к достоверному снижению жизнеспособности клеток гиппокампа мышей линии НТ-22. Соединения ГМЛ-1 и ГМЛ-3 защищали клетки от гибели при внесении как за 24 ч до, так и сразу после повреждения перекисью водорода, в концентрациях 10–6 – 10–9 М.

Ранее нами на основе β-изгиба 4-й петли нейротрофина-3 был сконструирован и синтезирован его миметик, гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина) (ГТС-301LL), проявивший свойства полноразмерного нейротрофина. ГТС-301LL активировал TrkC и TrkB рецепторы, обладал защитным действием на клетках HT22 в условиях окислительного стресса в концентрациях 10–5 – 10–12 М и антидепрессантоподобной активностью в тесте вынужденного плавания на мышах в дозах 10 – 40 мг/кг внутрибрюшинно. Для выявления стереоспецифичности эффектов ГТС-301 в настоящей работе синтезированы его LD-, DL- и DD-стереоизомеры и изучены их цитопротекторные и антидепрессантоподобные свойства в тех же условиях, что и для ГТС-301LL. Установлено, что оба вида активности исчезали при переходе от LL- к DL- и DD-стереоизомерам и сохранялись при переходе к LD-стереоизомеру. Таким образом, установлена стереоспецифичность фармакологических эффектов ГТС-301 по N-концевому остатку аспарагина, что свидетельствует о его ключевой роли во взаимодействии с рецептором.

На модели окислительного стресса нейропротекторный эффект дипептидного миметика 4-й петли NGF крысы ГК-2 проявлялся при внесении за 24 ч до повреждения в интервале концентраций 10–5 – 10–10 М, а при внесении сразу после повреждения — в концентрациях 10–5 – 10–7 М. ГК-2(h) — дипептидный миметик 4-й петли NGF человека — защищал нейроны НТ-22 от окислительного стресса в концентрациях 10–5 – 10–7 М при внесении за 24 ч до Н2О2 и в концентрации 10–5 М после повреждающего фактора. На клеточной модели болезни Паркинсона ГК-2(h) защищал клетки SH-SY5Y от 6-OHDA при внесении за 24 ч до токсина в интервале концентраций от 10–5 до 10–10 М, а после повреждения клеток — в концентрациях 10–5 – 10–7 М. ГК-2 также обладал цитопротекторным действием на клетках человека SH-SY5Y, но в более высоких концентрациях (10–5 – 10–6 М) как при внесении за 24 ч, так и после повреждения.

С использованием клеток линии НТ-22, нокаутных по генам рецепторов TrkA и TrkB, показано, что нейропротекторные свойства низкомолекулярного миметика 4-й петли NGF соединения ГК-2 (гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина)) при in vitro моделировании окислительного стресса, опосредованы селективным взаимодействием с TrkA-рецептором.

В настоящей статье представлен обзор авторских работ по изучению биохимических свойств оригинальных димерных дипептидных миметиков нейротрофинов фактора роста нервов и мозгового нейротрофического фактора in vitro и их нейропротекторной и нейрорегенеративной активности в условиях экспериментального ишемического инсульта, индуцированного транзиторной окклюзией средней мозговой артерии у крыс.

Представлен обзор работ, посвященный созданию и изучению фармакологически активных димерных дипептидных миметиков нейротрофинов NGF и BDNF. Они были созданы в НИИ фармакологии им. В. В. Закусова по заданию академика С. Б. Середенина с использованием оригинальной стратегии, заключающейся в конструировании миметиков отдельных петель нейротрофинов при сохранении наиболее экспонированных центральных дипептидных фрагментов бета-поворотных участков этих петель и димерного строения нейротрофинов. Описывается спектр фармакологических свойств этих миметиков и его зависимость от картины активации пострецепторного сигналинга Trk-рецепторов.

При моделировании острого социального стресса изучено влияние димерного дипептидного миметика мозгового нейротрофического фактора гексаметилендиамида бис(N-моносукцинил-L-серил-L-лизина) (ГСБ-106, лекарственная форма) при пероральном 3-дневном введении в дозе 0,1 мг/кг на предпочтение 1 % раствора сахара и уровень белка постсинаптической плотности PSD-95 в префронтальной коре и гиппокампе мышей С57Bl/6. У стрессированных мышей статистически значимо снижалось потребление сладкого раствора и вдвое уменьшалось содержание PSD-95 в префронтальной коре по сравнению с контрольными животными. В гиппокампе изменений содержания PSD-95 у стрессированных животных не выявлено. Введение ГСБ-106 в дозе 0,1 мг/кг перорально в течение 3 дней однократно после каждой сессии стресса полностью предотвращало развитие ангедонии по показателям потребления раствора сахара. Влияния ГСБ-106 на сниженное содержание PSD-95 в префронтальной коре стрессированных животных в период эксперимента не выявлено.

Изучено влияние низкомолекулярного миметика BDNF — соединения ГСБ-106 в таблетированной лекарственной форме на агедонию в тесте предпочтения раствора сахара и синаптогенез в гиппокампе (Вестерн-блот анализ) при однократном введении внутрь мышам линии C57Bl/6, находящимся в депрессивно-подобном состоянии, вызванном социальным стрессом, в сравнении с трициклическим антидепрессантом амитриптилином. У стрессированных мышей наблюдали статистически достоверное снижение предпочтения раствора сахара в среднем на 5 % (p = 0,04), а также уменьшение содержания синаптофизина в ткани гиппокампа на 27 % (p = 0,01), по сравнению с интактными мышами. ГСБ-106, как и амитриптилин, полностью восстанавливал предпочтение мышами раствора сахара и вызывал тенденцию (p = 0,08) к восстановлению содержания синаптофизина в гиппокаме. Таким образом, дипептидный миметик BDNF ГСБ-106 при однократном пероральном введении мышам на фоне хронического социального стресса оказывал антиагедонический эффект и улучшал нарушенную пластичность мозга.

Ранее в НИИ фармакологии имени В. В. Закусова был создан димерный дипептидный миметик наиболее экспонированной 4-й петли фактора роста нервов (NGF) гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) (ГК-2), активирующий специфические TrkA рецепторы и обладающий нейропротекторной активностью in vitro (10–5 – 10–9 М) и in vivo (0,1 – 10 мг/кг ip, po). В данной работе на основе бета-изгиба (-Lys32-Gly33-Lys34-Glu35-) 1-й петли NGF сконструирован и синтезирован ее миметик гексаметилендиамид бис-(N-аминокапроил-глицил-L-лизина) (ГК-6). В структуре ГК-6 был сохранен центральный дипептидный фрагмент бета-изгиба -Gly33-Lys34-, остаток -Lys32 заменен на его биоизостер — остаток 6-аминокапроновой кислоты и димерная структура NGF воспроизведена димеризацией по С-концу с помощью бивалентного гексаметилендиаминового спейсера. Для изучения связи структуры и активности ГК-6 проведена последовательная замена боковых групп а.о. пептида на водород и получены гексаметилендиамиды бис-(N-ацетил-глицил-L-лизина) (ГТС-611) и бис-(N-аминокапроил-глицил-глицина) (ГТС-613). Миметик ГК-6 и его аналог ГТС-613, содержащие в своей структуре N-аминокапроильный радикал, обладают нейропротекторным эффектом в концентрациях 10–6 и 10–5 М в условиях окислительного стресса на культуре нейронов HT22. Дипептид ГТС-611, в котором аминокапроильный фрагмент заменен на ацетильный, в этих условиях нейропротекторной активностью не обладал, что говорит о важности Lys32 в NGF для ее проявления. В отличие от миметика 4-й петли ГК-2, миметики 1-й петли ГК-6 и ГТС-611 проявляли дифференцировочную активность на клетках PC12.

Ранее в НИИ фармакологии имени В. В. Закусова был создан димерный дипептидный миметик фактора роста нервов гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) (ГК-2), активирующий специфические TrkA рецепторы и обладающий нейропротекторной активностью in vitro (10 – 5 – 10 – 9 М) и in vivo (0,1 – 10 мг/кг ip, po). ГК-2 был сконструирован на основе бета-изгиба (-Asp94-Glu95-Lys96-Gln97-) 4-й петли NGF, при этом был сохранен центральный дипептидный фрагмент -Glu95-Lys96-, а остаток -Asp94 заменили на его моносукцинильный биоизостер. Димерная структура NGF была воспроизведена с помощью бивалентного гексаметилендиаминового спейсера. Для изучения связи структуры и нейропротекторной активности ГК-2 в настоящей работе был осуществлен глициновый скан, т.е. проведена последовательная замена боковых групп пептида на водород. Полученные гексаметилендиамиды бис-(N-ацетил-L-глутамил-L-лизина) (ГК-2Ас), бис-(N-моносукцинил-глицил-L-лизина) (ГК-2-Gly1), бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-глицина) (ГК-2-Gly2) были менее активны: они обладали нейропротекторной активностью in vitro в условиях окислительного стресса на клетках НТ22 в концентрациях, в 10 – 100 раз больших, чем ГК-2. Делается вывод о том, что для проявления полноценной нейропротекторной активности миметика 4-й петли NGF димерного дипептида ГК-2 важно наличие каждого бокового радикала ГК-2. В то же время удаление любого из боковых радикалов, вероятно, не изменяет активной структуры бета-изгиба, и 2 остающихся боковых радикала сохраняют способность связываться со своими субсайтами на TrkA, чем и можно объяснить сохранение нейропротекторной активности у глициновых аналогов ГК-2.

Ранее нами на основе бета-изгиба 4-й петли фактора роста нервов получен димерный дипептидный миметик ГК-2, гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина), который активировал TrkA-рецептор и проявлял нейропротекторную активность in vitro (10–5 – 10–9 М) и in vivo (0,05 – 5 мг/кг внутрибрюшинно). Для изучения влияния длины димеризующего спейсера на проявление нейропротекторной активности были синтезированы и исследованы аналоги ГК-2 (11 сигма-связей): тетраметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) (ГК-2в); пентаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) (ГК-2б); триметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизил-6-аминогексановой кислоты) (ГК-2а), содержащие соответственно 9, 10 и 22 сигма-связи между Ca-атомами лизина дипептидных фрагментов. Исследование нейропротекторной активности in vitro на нейрональной культуре HT-22 в условиях окислительного стресса, вызванного перекисью водорода, позволило установить, что при увеличении расстояния между дипептидными фрагментами от 11 до 22 сигма-связей происходит снижение нейропротекторного действия в 10000 раз по минимальной действующей концентрации. При уменьшении этого расстояния от 11 до 10 сигма-связей (ГК-2б) выраженность нейропротекторного действия незначительно снижается, а при 9 сигма связях (ГК-2г) активность исчезает. Таким образом, оптимальным является гексаметиленовый спейсер, несмотря на то, что расстояние по данным рентгеноструктурного анализа между соответствующими аминокислотными остатками в природном NGF существенно больше и соответствует 33 сигма-связям. Это противоречие может быть связано с тем, что во взаимодействии с TrkA-рецептором участвуют 2 молекулы миметика, связанные солеобразованием. Другое возможное объяснение состоит в том, что молекулы TrkA способны сближаться в присутствии бис-дипептида ГК-2 теснее, чем при участии NGF.

Ранее нами на основе данных о гомодимерной структуре фактора роста нервов и наиболее экспонированном фрагменте – бета-изгибе 4-й петли нейротрофина, был получен димерный дипептидный миметик ГК-2, гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина), который активировал TrkA и проявлял нейропротекторную активность in vitro (10–5 – 10–9 М) и in vivo (0,05 – 5,00 мг/кг, ip). В настоящей работе был синтезирован мономерный дипептидный миметик ГК-1, амид N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина. На нейрональной культуре HT-22 в условиях окислительного стресса было показано, что ГК-1 в концентрации 10 – 5 М обладает антагонистической активностью, уменьшая выживаемость нейронов и противодействуя нейропротекторным эффектам NGF и ГК-2. Также с помощью Вестерн-блот анализа установлено, что ГК-1 снижает фосфорилирование TrkA-рецептора. Таким образом, мономерный миметик NGF ГК-1 является антагонистом TrkA-рецептора.

Ранее нами на основе бета-изгиба 4-й петли фактора роста нервов был получен димерный дипептидный миметик ГК-2, гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина), который активировал TrkA и проявлял нейропротекторную активность in vitro (10–5 – 10–9 М) и in vivo (0,05 – 5 мг/кг внутрибрюшинно). В настоящей работе синтезированы 2 его диастереомера, гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-D-лизина) (ГК-2LD) и гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-D-глутамил-L-лизина) (ГК-2DL). Изучение их нейропротекторной активности на нейрональной культуре HT-22 в условиях окислительного стресса показало, что замена остатка L-лизина на D-лизин приводит к значительному уменьшению активности, а замена остатка L-глутаминовой кислоты на D-стереоизомер приводит к ее полному исчезновению. Сделан вывод об участии обоих остаков дипептида во взаимодействии с рецептором TrkA.

Материалы V съезда фармакологов России «Научные основы поиска и создания новых лекарств» (14-18 мая 2018 года, г. Ярославль)

Материалы V съезда фармакологов России «Научные основы поиска и создания новых лекарств» (14-18 мая 2018 года, г. Ярославль)

Материалы V съезда фармакологов России «Научные основы поиска и создания новых лекарств» (14-18 мая 2018 года, г. Ярославль)

Синтезирован ряд С-замещенных N-фенилацетилглицилпролинов и изучена связь их структуры и антигипоксической активности в условиях нормобарической гипоксии в дозах 0,1 – 1 мг/кг внутрибрюшинно в зависимости от С-замещения. Показано, что антигипоксической активностью обладают амид и этиловый эфир N-фенилацетилглицил-L-пролина, способные в биологических средах циклизоваться с образованием цикло-пролилглицина, идентичного эндогенному пептиду с антигипоксической, нейропротективной и другими видами нейропсихотропной активности. Антигипоксический эффект был стереоспецифичен: D-энантиомеры были неактивны. У этих соединений обнаружена и нейропротективная активность на клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y в условиях 6-оксидофаминовой нейротоксичности в диапазоне концентраций 10 – 7 – 10 – 5 М. Метиламид N-фенилацетилглицилпролина и аналог с открытой карбоксильной группой, неспособные циклизоваться в циклопролилглицин, были неактивны. Делается вывод, что активность замещенных глипролинов связана с их превращением в цикло-пролилглицин.