旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒的研发提供依据.试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-N,将pET32a-N转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经诱导表达获得重组N蛋白,纯化后经Western blot方法检测其反应原性,免疫昆明小鼠制备重组N蛋白多克隆抗体并进行效价测定(间接ELISA法)和特异性验证(间接免疫荧光法).结果显示:重组N蛋白在IPTG终浓度为1.0mmol/L,37℃诱导表达6 h的条件下可获得最高表达量,该重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达;Western blot结果显示,纯化后的重组N蛋白可以和PDCoV阳性猪血清发生特异性结合,具有良好的反应原性.制备的多克隆抗体的效价可达1:64 000,间接免疫荧光法结果表明其能特异性识别和结合PDCoV,说明重组N蛋白具有较好免疫原性.提示:PDCoV N蛋白抗原性好,可作为诊断试剂盒的候选抗原.

青头鸭是两广地区对本地公麻鸭饲养日龄达到120天以上后,以头及颈上部羽毛呈孔雀绿色,背和腰部羽毛呈棕褐色,胸部羽毛呈棕黑色,腹部羽毛呈灰白色,翅膀内侧为芦花羽,尾羽毛呈黑绿色并向上卷曲为特征的一种土鸭的俗称.成熟后的青头鸭体重一般有2.5千克～3.0千克.

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达纯化的PEDV S2重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PEDV重组S2蛋白的间接ELISA抗体检测方法.结果显示,重组蛋白抗原最佳包被量0.8 μg/孔;血清最佳稀释倍数为1 ∶40,最佳血清孵育时间为120 min;酶标二抗最佳工作浓度为1 ∶4000,最佳二抗反应时间为45 min;最佳底物显色时间为15 min;待检血清样品S/P值＞0.212时判定为阳性,待检血清样品S/P值＜0.188时判定为阴性,当0.188≤待检血清样品S/P值≤0.212时判定为可疑.以S2蛋白作为包被抗原建立的PEDV抗体间接ELISA方法仅对PEDV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪丁型冠状病毒等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性.该方法检测灵敏度较高、重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于10％.利用本研究建立的PEDV S2蛋白间接ELISA抗体检测方法对广西地区不同阶段猪群血清样品共计622份进行检测,总体样品阳性率为76.05％,不同阶段阳性率相差较大.本实验建立的ELISA方法可应用于临床样品PEDV抗体检测以及PEDV血清流行病学调查.

Abstract To exploring the effects of probiotics on growth performance, immune function, blood biochemical indicators and cecal flora of broilers, 5 native experimental probiotics (Bacillus coagulans, Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis and Enterococcus faecalis) were isolated and purified. Broilers Fufeng and Sanhuang were divided: 5 single experimental probiotic groups, 1 mixed experimental probiotic group (Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Enterococcus faecalis), commercial probiotics group and negative control group. Each group had 10 replicates of each type of broilers. The experimental probiotics were added to broiler’s diet during experimental period. The growth performance was measured on 21d, 42d and 77d while the immune function, blood biochemical indexes and cecal flora were measured on 77d. The growth performance results showed that experimental probiotics could effectively increase the FCR and BWG (P <0.05); Thymus indexes (P <0.05), spleen indexes and bursa indexes were increased; The levels of IgA, IgG and IL-2 were significantly increased (P <0.05); The contents of total protein (P <0.05) and albumin increased while the total cholesterol, triglycerides (P <0.05), urea nitrogen and blood glucose (P <0.05) were decreased; The population of LAB increased (P <0.05) while E.coli decreased (P <0.05) in caecal. These results indicated that different experimental probiotics had different degree of effects on experimental broilers, but their effects were similar. And the combination of several types of experimental probiotics had a more stable beneficial effects which indicated that the isolated experimental probiotics can be used as broiler feed additives to improve broiler s immunity and health in Guangxi.

2020年10月份—2021年2月份,广西某养鸽场鸽群陆续出现乳鸽及种鸽死亡、鸽胚孵化率降低、部分种鸽有神经症状等情况,为了查找病因、确定诊治方案、降低经济损失,通过病史及用药史询问了解鸽群基本情况,采用临床检查、RT-PCR、血凝抑制试验、显微镜镜检及细菌分离鉴定等方法对病鸽进行综合诊断,并采用药敏试验选择有效药物,根据综合诊断及试验结果,对鸽场患病鸽群进行针对性防治并提出鸽场合理化防控建议.结果表明:该鸽场患病鸽确诊感染鸽Ⅰ型副黏病毒(pi-geon Paramyxo virus Ⅰ,PPMV-Ⅰ),并发感染大肠杆菌、沙门氏菌和毛滴虫,分离菌株的混合菌液对亚胺培南、头孢替坦、多黏菌素B、米诺环素、美罗培南、链霉素、阿米卡星高敏.通过对鸽群进行新城疫疫苗紧急免疫,对发病鸽群进行敏感药物系统治疗并辅以鸽舍消毒和杀菌,鸽群恢复正常,鸽场疫情得到有效控制.说明该鸽场鸽群感染了 PPMV-Ⅰ、大肠杆菌、沙门氏菌和毛滴虫,提示鸽场需提高生物安全意识,做好各类病原的防控措施及免疫程序.

为建立快速、准确的猪丁型冠状病毒(PDCoV)抗体ELISA检测方法,本研究以重组蛋白N作为包被抗原,建立了 PDCoV间接ELISA抗体检测方法.结果显示,经条件筛选,确定了该ELISA最佳反应条件:重组蛋白每孔包被0.2 μg;待检血清1:80稀释,孵育60 min;酶标二抗1:4 000稀释,反应30 min;底物显色10min.待检血清样品S/P值＞0.200时判定为阳性,S/P值＜0.173时判定为阴性,S/P值介于0.173和0.200之间则判为可疑.特异性试验结果表明,该检测方法不与HCV、FMDV、PRRSV、PRV、TGEV和PEDV的阳性血清发生交叉反应;重复性试验结果显示,批内变异系数为0.79％～4.75％,批间变异系数在1.92％～6.60％之间,表明重复性良好;敏感性试验结果显示,该方法可检测到血清最大稀释度为1:320.符合率试验结果显示,本方法与中和试验检测结果符合度高,阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为86.36％、96.43％和92.00％.利用本研究建立的ELISA方法对456份采自广西地区不同阶段猪群的血清样品进行检测,结果显示,总体样品阳性率为40.40％,不同阶段猪群抗体阳性率有较大区别,后备母猪的阳性率可高达100％,保育猪阳性率最低仅为3.90％.

为了解广西猪场伪狂犬病毒(PRV)感染和免疫状况,2017年1月—2020年12月,对部分猪场随机采样送检的血清样品,应用ELISA方法开展PRV血清抗体检测,并对检测结果进行不同年份、不同季节、不同地区、不同生长阶段猪群的统计分析.结果显示:从时间分布上看,2018年PRV gE抗体场阳性率(57.71％)和个体阳性率(24.75％)均最高,此后呈逐年下降趋势,其中个体阳性率下降明显(P<0.05),2020年下降至6.14％;各年间的PRV gB抗体场合格率差异不显著(P>0.05),均在90％以上,而2019年的个体阳性率(88.71％)最低,与其他年份差异显著(P<0.05).冬季PRV gE和gB抗体个体阳性率最低,分别为14.96％和89.35％,与其他季节差异明显(P<0.05);冬季gE抗体场阳性率(42.97％)最低,与春季、秋季差异不显著(P>0.05),但显著低于夏季(P<0.05),而gB抗体场合格率一年四季差异不显著(P>0.05),均在95％以上.从空间分布上看,广西14个地市猪场均存在不同程度的PRV野毒感染,其中玉林市最严重,场阳性率和个体阳性率分别为69.51％和35.86％,而钦州市最轻,分别为16.67％和4.07％;PRV gB抗体个体合格率普遍较高,均在84％以上.从不同生长阶段猪群上看,后备母猪、育肥猪PRV gE和gB抗体个体阳性率均显著低于其他生长阶段猪群(P<0.05),其中gE抗体个体阳性率在13％以下,而gB抗体个体阳性率不足80％.结果表明,近年广西规模猪场PRV野毒感染率较高,而疫苗免疫并不能完全阻止野毒株感染.建议通过PRV净化和提高规模猪场生物安全水平等措施来控制其流行.本研究为制定合理的猪伪狂犬病防控与净化策略提供了依据.

2018年5月,广西某县某猪场突然有70多头35日龄猪发病,病猪症状为消瘦、腹泻、气喘、腹式呼吸,其中20多头猪病死.病死猪剖检病变为淋巴结肿大、出血;肺充血、出血,与胸膜粘连;肝充血;脾有梗死点;肾充血,表面有散在的出血点;膀胱黏膜有散在的出血点.应用抗生素对病猪进行治疗无效.该猪场将其中5头病死猪每头分别采取淋巴结、肺、肝、脾、肾等病料送实验室检测.

为了查清引起母猪流产的原因,从送检流产胎儿的内脏组织中分离培养细菌,对分离菌株进行革兰氏染色镜检、药敏试验、生化试验、16S rDNA基因序列测定、同源性分析及系统进化树构建.结果表明,分离菌株为革兰氏阳性球菌,其生长特性、菌落特征、生化试验鉴定结果基本符合《常见细菌系统鉴定手册》中溶血葡萄球菌的生化特性;但在血琼脂培养基上并未出现溶血现象.药敏试验结果表明,分离菌株仅对新生霉素、利福平和米诺环素敏感,对青霉素类、头孢类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等药物严重耐药.分离菌株16S rDNA基因与12株不同来源的溶血葡萄球菌同源性在99.8％～99.9％之间,与溶血葡萄球菌MER TA39菌株(KT719446.1)遗传进化距离最相近.小鼠致病性试验表明,分离菌株能导致小鼠出现行动迟缓、扎堆和被毛燥乱等临床症状,并能从小鼠体内分离出相同形态特征和菌体特征的菌株.表明从猪流产胎儿体内分离到的菌株是存在多重耐药性的γ-溶血葡萄球菌.

为进一步了解近年广西猪场蚊媒携带乙型脑炎病毒(JEV)情况,采用套式RT-PCR(RT-nPCR)检测方法,于2016年—2019年间对猪乙型脑炎(JE)确诊阳性病例的部分猪场进行蚊子携带JEV情况初步检测调查.对抽选16个有JE阳性病例的猪场捕捉的蚊子进行JEV检测,结果均为阳性.表明广西猪JE确诊阳性病例猪场的蚊子携带JEV的几率很高.

为掌握广西地区导致猪群腹泻的主要病毒性病原的流行态势,为养殖场猪病毒性腹泻的综合防控提供依据,用实时荧光RT-PCR检测方法,对2017年1月—2021年6月广西14个地市489个猪场1206份临床腹泻样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)等病原检测,并分析其阳性检出率在不同年份、季节、地区、年龄段猪群之间的差异以及病原混合感染情况.结果显示,2017—2021年,PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV样品阳性检出率分别为49.67％、7.63％、4.56％和0.33％,场阳性检出率分别为53.37％、8.18％、8.18％和0.61％;病毒性腹泻病原有一定的季节性流行特征,多表现为冬、春季流行加重;PEDV、PDCoV普遍流行,PoRV局部流行,TGEV散发流行;4种病原对不同年龄段腹泻猪群的感染率存在差异,其中对哺乳仔猪危害最为严重;猪群以单一感染为主,主要为PEDV单一感染,阳性检出率为47.93％,混合感染均为二重感染且感染率较低.结果表明,导致广西地区猪群腹泻的主要病毒性病原主要为PEDV、PDCoV和PoRV,其中PEDV为最主要病原,其他病原也呈流行加重趋势,需进一步加强病原监测和疫病综合防控.

Newcastle disease is an important poultry disease that also affects Columbiform birds. The viruses adapted to pigeons and doves are referred to as pigeon paramyxoviruses 1 (PPMV-1). PPMV-1 are frequently isolated from pigeons worldwide and have the potential to cause disease in chickens. The complete genomes of 18 PPMV-1 isolated in China during 2012–2018 were sequenced by next-generation sequencing (NGS). Comprehensive phylogenetic analyses showed that five of the viruses belong to sub-genotype VI1.2.1.1.2.1 and 13 isolates belong to sub-genotype VI.2.1.1.2.2. The results demonstrate that these sub-genotypes have been predominant in China during the last decade. The viruses of these sub-genotypes have been independently maintained and continuously evolved for over 20 years, and differ significantly from those causing outbreaks worldwide during the 1980s to 2010s. The viral reservoir remains unknown and possibilities of the viruses being maintained in both pigeon farms and wild bird populations are viable. In vivo characterization of the isolates’ pathogenicity estimated mean death times between 62 and 114 h and intracerebral pathogenicity indices between 0.00 and 0.63. Cross-reactivity testing showed minor antigenic differences between the studied viruses and the genotype II LaSota vaccine. These data will facilitate PPMV-1 epidemiology studies, vaccine development, and control of Newcastle disease in pigeons and poultry.

筛选优质鸡源益生菌菌种,为畜禽微生态制剂的研发提供优质的菌株来源,为开发禽用微生态制剂提供安全高效菌种资源和理论支撑.试验以健康鸡肠道为分离材料,使用MRS培养基(乳酸菌细菌培养基)进行分离培养,并对分离菌株进行形态特征、生理生化鉴定及分子生物学鉴定.试验研究发现在鸡盲肠中分离获得一株细菌,鉴定为发酵乳杆菌,编号为J4.分离获得的菌株具有耐热、耐酸、耐胆盐等特点,同时对动物机体安全无毒,可作为鸡源发酵乳杆菌益生菌的优良候选株.

本研究旨在了解引起仔猪腹泻的主要病毒性病原感染情况及流行特点,为有效防控广西仔猪腹泻提供科学依据.试验采用RT-PCR/PCR检测方法对2016年3月至2019年2月广西14个地级市366个规模猪场送检的914份仔猪腹泻病料样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病病毒(PRV)检测,并分析其阳性率在不同年份、季节、地区之间的差异及病原混合感染情况.调查结果显示,PEDV、PDCoV、PRRSV、PoRV、PCV2、CSFV、PRV均存在不同程度的感染,其样品平均阳性率分别为59.74％、8.32％、7.77％、4.92％、3.72％、3.28％和2.08％,未检测出TGEV;PEDV已无明显季节性,一年四季均高发,即使在炎热的夏季,在感染猪群中也持续存在,PDCoV有明显的季节性,多发生在冬春寒冷季节;广西仔猪腹泻PEDV阳性率高,单一感染高达50.55％,仔猪腹泻混合感染情况也较多,其中以二重感染情况较为常见,同时也存在四重感染现象.结果 表明,广西腹泻仔猪存在7种病毒性病原不同程度感染情况,其中以PEDV导致的仔猪病毒性腹泻尤为严重,新发PDCoV阳性率仅次于PEDV,需重视并加强对新发PDCoV的防控.

为了解广西猪群猪圆环病毒3型(PCV3)的遗传变异情况,以PCV3阳性DNA为模板,利用PCR的方法分2段扩增PCV3全基因序列并进行拼接,获得10株PCV3全基因组序列,全长均为2 000 bp.10株广西PCV3全基因组序列之间的核苷酸同源性为98.6％～ 99.8％.与国内其他毒株的同源性为97.9％ ～ 99.8％;与国外其他毒株的同源性为98.8％～99.7％.10株广西PCV3 Cap基因的大小均为645 bp,编码214 aa.PCV3 Cap基因比较保守,10株广西PCV3 Cap基因与参考株相比,仅存在散在的突变位点.基于PCV3全基因和Cap基因构建的遗传进化树显示,两者结果基本相同,10株广西PCV3处于3a和3b两个亚群.本试验表明,广西地区猪群中流行的PCV3至少存在2个亚群,不同亚群PCV3毒株的致病性差异还有待进一步的研究.

本研究旨在确定猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株CH/GX/750A/2015株在Vero细胞上转瓶培养的最佳条件,为大规模生产高效PEDV变异株疫苗提供技术支撑.试验以10 L转瓶培养病毒,对接毒时细胞维持液中胰酶浓度(0、2、4、6、8和10 μg/mL)、细胞密度(40％、60％、80％、100％、200％)、接毒剂量(MOI分别为1、0.1、0.01和0.001)、吸附时间(0、30、60、90、120、240 min)、收毒时间(接毒后12、24、36、48、60、72 h)、维持培养温度(35、36、37和38℃)和转瓶转速(6、8、10、12、14、16 r/h)7个条件进行优化.结果 显示,PEDV CH/GX/750A/2015株在10 L转瓶中的最佳培养条件为:细胞刚铺满单层时接毒,接毒量为MOI=0.01,维持液(无血清DMEM培养液)中胰酶质量浓度为6 μg/mL,不需吸附,维持培养温度为37℃,12 r/h旋转培养48 h后收获病毒液可获得较高效价的病毒液,效价可稳定达到106.50TCID50/0.1 mL.本试验为PEDV变异株大量培养提供了参考,为变异株疫苗研发奠定了基础.

为了解广西规模猪场猪群中主要呼吸道疫病的感染情况及流行特点,给制定科学合理的防控方案提供理论依据,采用RT-PCR/PCR方法,对2015年3月至2019年2月采集自广西14个地市规模猪场的1 114份具有呼吸道症状病猪样品进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪肺炎支原体(Mhp)、副猪嗜血杆菌(HP)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)等7种主要疫病病原检测,并分析其样品阳性率在不同年份、季节之间的差异及病原混合感染情况.调查结果显示:CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、Mhp、HP和APP均存在不同程度的感染,7种病原的样品平均阳性率从高到低依次为PRRSV(45.87％)、PCV2(38.96％)、HP(25.31％)、CSFV(10.05％)、PRV (6.19％)、Mhp (4.76％)及APP(1.89％);从季节影响因素分析,PRRSV在秋季阳性率较高,PCV2在夏季阳性率较高,HP在秋、冬季阳性率较高,其他病原阳性率的季节性差异均不明显;从混合感染情况分析,7种病原引起的单一感染中,PRRSV (16.52％)阳性率最高,其次是PCV2 (9.78％),混合感染包括二重感染、三重感染、四重及以上感染,其中二重感染以PRRSV+PCV2(10.77％)、PRRSV+HP (6.10％)、PCV2+HP (4.49％)为主,三重感染以PRRSV+PCV2+HP (4.49％)为主,四重及以上感染情况较少.调查表明,近年广西地区规模猪场呼吸道疫病仍较多发,全年均有发生,且多为混合感染,PRRSV、PCV2和HiP为猪主要呼吸道疫病病原.

本研究旨在了解新发猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)在广西猪群的感染情况及流行特点,为有效防控PCV3提供科学依据.试验采用PCR检测方法对2017年9月至2019年3月广西482个规模猪场送检的917份病猪样品进行PCV3检测,并分析PCV3阳性率在广西不同地区、年份、季节和年龄段猪群之间的差异.对145份PCV3阳性病料进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测.结果 显示,PCV3除在百色、防城港未检出,在广西其他12个地市均存在不同程度的感染;2017～2019年广西PCV3样品阳性率和PCV3猪场阳性率均呈逐渐上升趋势;夏季PCV3阳性率最低,且明显低于其他3个季节;育肥猪PCV3阳性率最高,为21.70％,其次是流产母猪、保育猪、流产胎儿,阳性率分别为20.00％、19.05％和11.02％,哺乳仔猪PCV3阳性率最低,为8.21％;PCV3单一感染率较高,为30.34％6,与其他病原混合感染情况也较为常见,甚至出现四重感染.调查结果表明,PCV3感染在广西普遍存在,且近年来感染呈增加趋势,可能有一定的季节性,对各生长阶段猪群均有一定程度的危害,以育肥猪最为严重,对母猪和保育猪危害也较大;PCV3单一阳性率较高,但仍以混合感染为主,尤其是与PRRSV和PCV2的混合阳性率较高,提示这3种病原在感染致病过程中可能存在协同作用.

为了筛选优质猪源益生菌菌种资源,为畜禽微生态制剂的研究与开发提供优质候选菌株,试验以健康仔猪新鲜粪便为分离材料,通过高温处理分离芽孢杆菌,并对其进行形态特征、生化及分子生物学鉴定与益生特性研究.结果表明:从健康仔猪新鲜粪便中分离获得多株细菌,选取其中1株生长快速、形态特征典型的菌株进行鉴定,确定该分离菌为枯草芽孢杆菌.益生特性研究表明,该分离菌菌株具有较强的耐热、耐酸、耐胆盐等益生特性,同时具有一定的拮抗致病菌作用,对大部分抗生素敏感,对小鼠无毒副作用,可作为畜禽微生态制剂菌种的候选菌株.