为了给规模化生产牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)提供悬浮细胞培养方法,本试验采用4种降血清方法,使贴壁MDBK细胞逐步适应了悬浮培养环境,最终获得了 1株MDBK悬浮细胞株,同时摸索出MDBK悬浮细胞株培养BVDV和IBRV抗原的最佳参数;将MDBK悬浮细胞株扩大到60 L和500 L后连同MDBK贴壁细胞一同接种BVDV和IBRV,比较3种细胞培养后的病毒滴度;通过使用悬浮培养方法制备BVDV-IBRV二联灭活疫苗,按照2.00、1.00、0.50 mL/头和0.25 mL/头4个剂量免疫健康牛,确定其攻毒保护效果,继而免疫不同年龄黑白花奶牛群体(包括犊牛、后备母牛和成年母牛),检测免疫后牛群的BVDV和IBRV中和抗体效价.结果显示:在60 L和500 L规模化放大培养过程中,IBRV 病毒滴度各为 8.25 lgTCID50/mL 和 8.00 lgTCID50/mL,BVDV 病毒滴度各为 8.00 lgTCID50/mL 和 7.75 lgTCID50/mL,与MDBK贴壁细胞株产毒毒价几乎相同;免疫攻毒保护试验中,最低免疫剂量为1.0 mL/头,免疫保护率能在80％以上;二联灭活苗免疫的牛群试验中,IBRV和BVDV中和抗体几何平均值均显著高于未免疫组,达到了免疫保护效果.结果表明,本试验成功筛选到1株MDBK悬浮培养细胞株,并且通过悬浮培养工艺制备的BVDV-IBRV二联灭活疫苗免疫效果良好,该MDBK细胞全悬浮培养株的成功驯化为疫苗规模化制备提供了科学依据.

为研究免疫塞内卡病毒(SVA)灭活疫苗后豚鼠、家兔与猪血清中和抗体的相关性,分别用0.25、0.5、1.0、2.0 mL的SVA灭活疫苗接种豚鼠和家兔,同时以2.0 mL的SVA灭活疫苗接种猪,分别于免疫前以及免疫后第7天、第14天、第21天、第28天采血液,测定各动物血清中SVA中和抗体,利用Microsoft Excel软件对所得结果进行整理并分析豚鼠与猪血清SVA中和抗体、家兔与猪血清SVA中和抗体之间的线性关系,进一步采用IBM SPSS Statistics 19软件对线性关系的显著性进行分析.结果显示,豚鼠和家兔均可产生SVA中和抗体,且免疫剂量越大,免疫动物产生的SVA中和抗体滴度越高.猪免疫后产生了SVA中和抗体,监测期内随着时间的延长,SVA中和抗体水平逐渐升高.当家兔和豚鼠免疫剂量为1.0 mL时,二者产生的SVA中和抗体与猪SVA中和抗体呈正相关,相关性分别为0.990和0.998,相关性极显著.研究表明,采用1.0 mL的剂量免疫豚鼠或家兔,能间接反应SVA灭活疫苗在猪体的SVA中和抗体水平.

为了提高BPIV-3灭活疫苗产能及稳定性,初步探究了在MDBK悬浮细胞中的培养条件.将种毒按不同接种比例在MDBK-S悬浮细胞中,72h后收获病毒液,测定TCID50,探究最佳的病毒接种量;按2％的种毒接种在不同密度的悬浮细胞中,72h收获病毒液,通过测定TCID50,探究最佳的细胞密度;将2％的种毒接种在2.0×106cells/ml的悬浮细胞中,于接毒后不同时间收获病毒液,测定TCID50,探究最佳的收毒时间;在最佳培养条件的基础上,与贴壁毒TCID50做对比.结果表明,病毒接种比例为2％,MDBK悬浮细胞密度为2.0×106cells/ml,接毒后72h收获,病毒TCID50最高;悬浮细胞产毒能力比贴壁细胞高.

塞内卡病毒(SVA)引发的疫病在我国迅速蔓延,但是对该病毒的理化特性了解甚少.本试验分析了SVA SVV/CH/ZZ/2016株对有机溶剂、蛋白酶、高温、酸和碱的耐受性.结果 表明,SVA毒株对乙醚、氯仿、胰蛋白酶和酸具有较强耐受性,但对pH ＞7.0的碱性环境却表现非常敏感.当SVA毒株暴露在温度高于56℃时,SVA效价显著下降.结果 说明,由于这些极端的物理和化学环境破坏了病毒表面蛋白配体结构的正确性和完整性,阻碍了与细胞受体的结合和病毒对细胞受体的吸附.在此,我们报告了理化因素可改变SVA感染性的初步结果,其目的是提示理化因素对SVA影响值得做进一步研究,以确定SVA SVV/CH/ZZ/2016株在国内猪群中的致病机制和流行病学机制及相关因素,为SVA的预防、治疗和新疫苗开发提供可靠的数据.

为建立犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的CAV Hexon基因序列和CPV VP2基因序列,设计了2对特异性引物和2条TaqMan探针.经过条件优化建立了检测CAV和CPV的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果 显示,以含有CAV Hexon基因和CPV VP2基因的重组质粒标准品为模板绘制标准曲线,其相关系数(R2)均大于0.990,CAV和CPV荧光定量PCR均具有良好的线性关系.特异性试验结果显示,该方法仅对CAV-Ⅰ型、CAV-Ⅱ型和CPV检测结果为阳性,而对犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬冠状病毒检测结果均为阴性,表明其特异性强.该方法的敏感性检测结果显示其检测下限为10拷贝/μL.重复性试验结果显示该方法的组内和组间变异系数均小于2％,表明该方法重复性好.利用普通PCR方法与本实验建立的方法分别对感染CAV(10份)和CPV(27份)的犬模拟病料样品进行检测,两种方法对CAV和CPV检测的符合率分别可达100％和96.30％.本研究建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于CAV和CPV的临床检测.

研究采用有限稀释法将MDBK细胞进行克隆,并放大培养.将2种生物型(致细胞病变型和非致细胞病变型)的牛病毒性腹泻/黏膜病毒混匀,接种克隆的MDBK细胞并收获毒液.采用间接免疫荧光技术检测病毒含量,筛选BVDV敏感细胞.试验成功获得4株单克隆细胞,其中C3株对病毒高度敏感且产毒稳定,确定为BVDV敏感细胞株.

为建立一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR方法,研究针对塞内卡病毒3C基因保守区域设计了一对引物和探针,将3C基因克隆到pCR-4 TOPO载体中,以重组质粒为标准品,通过优化PCR反应条件,建立了一种检测SVA的实时荧光定量PCR方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到2.5×10 copies/μL,灵敏度高于普通PCR;与其他相关病毒及细菌均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于4％,具有良好的稳定性.研究建立的一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR方法可以检测SVA的定性和定量,对SVA快速诊断检测具有重要意义.

为简便、快速地区分与鉴定伪狂犬病毒感染,该研究针对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株设计了一种荧光定量PCR检测方法,分别选取伪狂犬病病毒gB基因和gE基因的保守区,设计相应引物和探针,通过建立双重荧光定量PCR方法,不仅可以区分临床中野毒株与基因缺失株感染,还可以对伪狂犬病毒进行定量分析.试验结果表明:该研究所建立的检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高,对猪伪狂犬病的诊断检测及疫苗生产具有重要的参考价值,有利于伪狂犬的免疫与净化.

在相同饲养条件下,用布氏菌病活疫苗(Rev.1株)和布氏菌病活疫苗(S2株)进行羊只的免疫,按照常规免疫剂量分别接种健康绵羊30只,并设空白对照10只,共计70只.免疫前和免疫后14、21、28、49、60、90、120、150 d采血,采用虎红平板凝集试验(RBT)和试管凝集试验(SAT)2种检测方法进行血清抗体检测.结果证实2种疫苗的免疫效果,为指导布鲁氏菌病的防治提供科学依据.

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道早期定植菌也是格拉泽病的病原体,给猪场带来较严重的经济损失.为了调查副猪嗜血杆菌血清型的流行情况,采用细菌分离培养、玻板凝集法及PCR方法,从广东、广西、山东、江苏、江西45个规模化猪场送检的疑似样品中共分离鉴定了34株副猪嗜血杆菌,其中6株(17.65％)血清4型、9株(26.47％)血清5型、8株(23.53％)血清12型、4株(11.76％)血清13型以及7株(20.59％)未定型菌株.为了有效地防控副猪嗜血杆菌病的流行,以4、5、12血清型优势流行血清型制备3价灭活苗,用仔猪免疫/攻毒试验评价3价灭活疫苗免疫保护力.动物实验表明,该疫苗对副猪嗜血杆菌4型、5型和1 2型具有较好的免疫保护能力.

从云南某牛场疑似BVDV感染的病料通过接种MDBK细胞分离到1株BVDV,为了解分离毒株的特性,进行了病原学和分子生物学研究.该分离毒株连传15代均不产生CPE,为NCP型BVDV.通过电镜检测可观察到直径为40～60 nm病毒粒子.该分离病毒能被牛病毒性腹泻标准阳性血清中和,且能被BVDV IFA荧光抗体识别;采用BVDV 5'-UTR基因特异性引物,经RT-PCR可扩增出288 bp特异性片段.将该片段测序后与GenBank已发表的30株BVDV 5'-UTR序列进行同源性比较,同源性为68.7％～89.2％.与我国分离的BJ1202株(登陆号:KF925514.1)和Y2株(登陆号:KY964311.1)同源关系最近,均为89.2％.与2014年以来我国分离的BVDV毒株亲缘关系在88％左右.5'-UTR遗传进化分析证实该分离毒株为BVDV-1型.动物回归试验显示,该分离毒株可引起出现体温升高、腹泻、粘膜病等典型的BVD/MD症状.结果表明,分离的毒株为BVDV,命名为BVDV/W株.

一、材料与方法 1.材料.MDBK细胞,金宇保灵兽用疫苗国家工程实验室保存.DMEM培养基、胰酶、低血清培养基,均购自赛默飞世尔科技有限公司.无血清悬浮培养基购自上海奥浦迈生物科技有限公司.

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV) TaqMan双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的BVDV 5'-UTR基因序列和IBRV gB基因序列,设计了2对特异性引物和2条TaqMan探针.结果显示以含有BVDV 5'-UTR基因和IBRV gB基因的重组质粒为模板绘制的标准曲线,其相关系数(R2)均大于0.990,线性关系较好.特异性试验结果显示,该方法仅对BVDV和IBRV检测为阳性,而对口蹄疫病毒、牛流行热病毒、牛副流感病毒、牛轮状病毒、牛巴氏杆菌、猪瘟病毒、牛支原体、牛、羊布鲁氏菌检测结果均为阴性,表明其特异性强.该方法的检测下限约为10拷贝/μL,重复性试验结果显示该方法的组内和组间变异系数均小于2％,利用OIE采纳的BVDV、IBRV荧光定量PCR方法与本实验建立的方法分别对47份牛病料样品进行检测,二者对BVDV和IBRV检测的符合率分别可达97.87％和100％.研究表明所建立的荧光定量PCR方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于BVDV和IBRV的双重定量检测.

为对基因Ⅰ型和Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)进行鉴别检测,本研究根据GenBank中已登录的基因Ⅰ型和Ⅱ型BVDV 5'非编码区(5'-UTR)的参考序列,设计了一对BVDV Ⅰ型和Ⅱ型通用引物和2条鉴别探针,建立了Ⅰ型和Ⅱ型BVDV双重TaqMan荧光定量PCR检测方法,并利用该检测方法进行临床样品检测.特异性试验结果显示,除Ⅰ型和Ⅱ型BVDV外,该方法对猪瘟、牛传染性鼻气管炎、口蹄疫病毒等均无扩增曲线.敏感性试验结果显示,该方法对Ⅰ型BVDV检测下限为10拷贝/μL,Ⅱ型BVDV检测下限为100拷贝/μL,敏感性高.重复性试验结果显示,该方法组内和组间变异系数均小于1％.临床样品检测结果显示,Ⅰ型和Ⅱ型BVDV双重TaqMan荧光定量PCR检测方法可鉴别Ⅰ型和Ⅱ型BVDV,检测结果与OIE认可的BVDV普通PCR扩增产物测序结果一致.本研究所建立的Ⅰ型和Ⅱ型BVDV双重TaqMan荧光定量PCR具有快速、准确、可鉴别等优点,可用于Ⅰ型和Ⅱ型BVDV的快速鉴别检测.

我国医疗技术和科学技术快速、稳定地发展,特别是在一些较为严重的传染病方面,我国医学技术处于国际先进水平.禽流感病毒是一种常见的病毒类型,这种病毒传播十分广泛,并且传播速度也极快,我国在对禽流感病毒检测的方法方面有很多研究.近年,环介导恒温扩增技术得到突飞猛进的发展,我国禽流感的检测具有快速、便捷的特点,在检测中也起到非常重要的作用,该文主要论述禽流感病毒的特点以及环介导恒温扩增技术对禽流感病毒的检测2个方面的内容.

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)引起的偶蹄兽的一种急性、热性、高度接触性传染病.该病感染途径多、传播速度快,严重危害畜牧业的发展和国际经济贸易的流通,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疾病,该病为必须上报的疾病.我国也将其列为一类传染病,并列为国家强制性免疫的动物疫病之一.根据口蹄疫血清型不同,口蹄疫病毒分为O、A、C、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ、AsiaⅠ七个型血清型,且各个血清型间没有交叉保护力,每个血清型又有很多亚型,型内不同毒株间的变异可导致抗原差异,这为口蹄疫的诊断和预防带来了极大的困难.

本研究旨在利用细胞中和实验方法测定单克隆抗体是否具有中和病毒的活性.利用细胞中和法测定两株包被(捕获)单克隆抗体3D7(含O/Mya98/XJ/2010株抗体)和7G3(含O/GX/09-7株抗体)对不同病毒的中和抗体值,验证这两株单抗是否具有中和病毒的活性.结果表明:7G3可以中和O/GX/09-7株病毒,但不能中和其他毒株病毒,虽然中和能力不强,但是特异性中和,进一步验证该抗体仅与O/GX/09-7株反应;3D7仅与缅甸98株发生特异性结合反应,与其他毒株均不产生反应,而且中和效价达1:128,属于具有中和能力的单抗抗体.

为准确掌握牛羊口蹄疫疫苗免疫效果,2012年对内蒙古自治区的牛羊口蹄疫O-Asia I型双价灭活疫苗和牛羊口蹄疫A型灭活疫苗免疫效果进行了监测.采用液相阻断ELISA方法,共检测了8个旗县23018份免疫牛羊口蹄疫O-Asia I型双价灭活疫苗和牛羊口蹄疫A型灭活疫苗15日、30日、60日的血清中口蹄疫免疫抗体水平.结果显示,牛羊口蹄疫疫苗免疫效果总体良好,免疫抗体合格率超过了70％.规模化奶牛养殖场免疫效果稳定,散养地区免疫效果稳定性差,且不同厂家的疫苗免疫效果不同,加强免疫后A、B、D三个厂家抗体合格率能达到100％,C厂家的免疫效果较差,抗体合格率为93.3％.采用3ABC-ELISA检测试剂盒对部分地区牛羊进行感染抗体检测,结果为阴性.

为了用激流式生物反应器纸片微载体培养BHK-21（C-13）细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗,采用纸片微载体培养BHK-21（C-13）细胞,接种狂犬病病毒Flury株（LEP）,测定病毒液滴度。将收获的病毒液制备兽用狂犬冻干活疫苗,按照狂犬病活疫苗规程进行检验。结果显示,3批收获的病毒液滴度平均达105.0LD50/0.03 mL;3批实验疫苗检验结果均符合质量标准。实验证明激流式生物反应器纸片微载体培养BHK-21（C-13）细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗提高了细胞密度、病毒滴度,增加了病毒液收获体积,减小了批间差,保证了产品均一性,适合工业化大生产。

In order to verify the specificity of sucrose density gradient measurement for FMDV particles(146S),three batches of purified 146S inactivated antigen solution were treated with specific acid PBS solution(pH6,5,4),then detected 146S in the acid hydrolysis samples.The results showed that OD259 detect peak of 8 to 11 fractions disappeared,which indicated that 146S didn't exist.But the content of 146S in the samples was 1.77,6.60 and 3.67 μg/mL respectively before acidolysis.At the same time,three batches of cell solution without virus were purified and inactivated.Then 146S was detected with sucrose density gradient technology.The results showed that three batches of cell solution in 8 to 11 fractions had no obvious absorption peak;OD259 values were basically consistent with the blank control,which showed that the cell solution without virus had no effect on the result.It indicated that this method was specific for detecting the amount of 146S in FMDV solution.